呼吸道九聯(lián)檢病原體抗體

檢測及其臨床意義檢驗科楊溪霖呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第1頁呼吸道感染呼吸道感染是指病原體感染人體鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)分為上呼吸道感染和下呼吸道感染呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第2頁上呼吸道感染常見急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎癥概稱，是呼吸道最常見一個傳染病常見病因為病毒，少數(shù)由細菌引發(fā)。患者不分年紀、性別、職業(yè)和地域。不但含有較強傳染性，而且可引發(fā)嚴重并發(fā)癥呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第3頁下呼吸道感染包含急性氣管/支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴張等由病毒、細菌、支原體、衣原體、軍團菌等微生物引發(fā)，其防治應(yīng)遵照預(yù)防為主、準確診療、及時治療標準，治療時必須明確引發(fā)感染病原體以選擇有效抗生素呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第4頁呼吸道病原體常見呼吸道病原體主要有病毒、細菌、支原體、衣原體和立克次體等據(jù)統(tǒng)計，90%以上急性呼吸道感染由病毒引發(fā)一個病原體可引發(fā)各種臨床癥狀，同一臨床表現(xiàn)可由各種病原體引發(fā)呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第5頁呼吸道病原體感染概況一、經(jīng)典“致病菌”細菌：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等

癥狀：經(jīng)典，咳嗽、膿性痰、胸膜炎性胸痛，普通都伴有發(fā)燒，或有膿血痰病史：①悠久，古代“瘟疫”很多細菌性肺炎

②重癥致死性肺炎很多是細菌性 ③上世紀50年代以前肺炎90%以上為細菌性肺炎，現(xiàn)在報道約在40%左右 ④肺炎鏈球菌大約占在60%呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第6頁呼吸道病原體感染概況二、非經(jīng)典病原體

①進展、開放概念，始用于20世紀30年代末，60年代首次發(fā)覺了非經(jīng)典病原體——肺炎支原體 ②泛指各種能引發(fā)肺炎、臨床表現(xiàn)與經(jīng)典肺炎不一樣各種病原體（廣義） ③臨床癥狀不經(jīng)典，差異大 ④在CAP中感染百分比逐年增加，據(jù)報道大約占40-60%，逐步引發(fā)各國醫(yī)療工作者注意呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第7頁（一）最常見非經(jīng)典病原體肺炎支原體、肺炎衣原體、軍團菌等（狹義非經(jīng)典病原體）①感染百分比高，超出“非典”50%②臨床癥狀：干咳為主，少痰或無痰，肺外癥狀較常見顯著，尤其軍團菌感染，表現(xiàn)相對較重，多臟器受累顯著。可有高熱、耳鳴、相對緩脈、血尿、腹痛、腹瀉、肝酶升高、電解質(zhì)紊亂、精神神經(jīng)癥狀等③β-內(nèi)酰胺類（青霉素類、頭孢類）、氨基糖苷類（鏈霉素）等藥品無效④治療：呼吸喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第8頁（二）病毒類流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、禽流感病毒等①季節(jié)性或區(qū)域性流行②臨床癥狀：干咳為主，少痰或無痰、呼吸困難，低氧血癥③治療：主要依靠對癥支持治療。早期抗病毒治療可能效果很好。預(yù)后取決于病毒類型和宿主對病毒反應(yīng)呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第9頁（三）真菌性肺炎念珠菌，曲菌，新型隱球菌，放線菌，組織胞漿菌，毛霉菌屬等①除組織胞漿菌為原發(fā)吸入性感染外，多數(shù)為條件致病②多發(fā)生在免疫低下患者和長時間接收廣譜抗生素治療患者白色念珠菌肺炎呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第10頁

小區(qū)取得性肺炎小區(qū)取得性肺炎（community-acquiredpneumonia,CAP）是指在非醫(yī)院環(huán)境中受感染因子侵襲所發(fā)生肺部炎癥，以及住院后48小時內(nèi)或特殊病原菌在潛伏期10天內(nèi)所患肺炎，又稱院外取得性肺炎。這種肺炎之所以被叫做”小區(qū)取得性肺炎”是因為它很輕易從小區(qū)中一個組員傳輸?shù)搅硪粋€。CAP發(fā)病率為4.7%-11.6%，其中22%-51%CAP需住院治療；住院CAP死亡率7%，重癥CAP死亡率29%。（數(shù)據(jù)來自西班牙）呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第11頁

小區(qū)取得性肺炎

美國：感染率第一位疾病美國：每年560萬感染肺炎，感染率5-10人/1000人/年WHO：第二大死因，僅次于心血管疾病中國：第五大死因中國：兒童死亡第一病因

呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第12頁各病原體在CAP中感染率《各國小區(qū)取得性肺炎指南對非經(jīng)典病原體重視情況》《肺炎診療與治療研究進展》數(shù)據(jù)起源：《重視非經(jīng)典病原體在CAP致病中作用》《要重視非經(jīng)典病原體在小兒呼吸道疾病中致病作用》等呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第13頁呼吸道病原菌合并感染分析119例小兒肺炎細菌感染97例，細菌感染及肺炎支原體同時感染19例。------檢驗醫(yī)學(xué)與臨床年12月第6卷第23期在SARS發(fā)病前階段，合并MP感染陽性率為69．3％(39／56)；發(fā)病后階段，合并MP感染陽性率為l8．6％(8／43）------JoumalofTropicalMedicineVo1．3No．3Sep．Mpn和Cpn合并陽性有27例．占總陽性數(shù)45．0％------中國優(yōu)生與遺傳雜志年第9卷第3期9例(1．2％)患兒MP-IgM和Cpn．IgM同時陽性；------世界感染雜志年第6卷第4期此次調(diào)查同時檢測了8種感染呼吸道常見病毒，結(jié)果提醒Mp、Cp多混合有病毒感染。-------中國人獸共患病雜志：1002-2694()03—0269-02呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第14頁小區(qū)取得性肺炎青霉素問世前：CAP80%以上是由肺炎鏈球菌所致。1928年英國科學(xué)家弗萊明發(fā)覺青霉素：拯救了千百萬肺炎患者生命，肺炎鏈球菌雖仍是CAP最常見病原體，但百分比已顯著下降。非經(jīng)典病原體：如：肺炎支原體、肺炎衣原體、病毒、嗜肺軍團菌等，顯著上升!在非經(jīng)典病原體感染中，

支原體肺炎病毒性肺炎尤其最為常見。呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第15頁非經(jīng)典呼吸道病原體這些病原體變異快，傳輸廣，因為不易形成長久免疫力而難以預(yù)防和控制流感病毒副流感病毒病毒呼吸道合胞病毒腺病毒呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第16頁呼吸道病原體檢測現(xiàn)有主要方法：病毒分離培養(yǎng)抗原檢測抗體檢測分子生物學(xué)方法等呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第17頁檢測方法比較檢測方法優(yōu)點缺點病毒分離培養(yǎng)特異性高，金標準培養(yǎng)條件要求高、靈敏度低，標本中病原體量少時，易致假陰性?？乖瓩z測直接免疫熒光法簡便、快速、靈敏度和特異性均較高且可用于疾病早期診療需要特異性抗體、熒光顯微鏡，易受采樣限制抗體檢測間接免疫熒光法靈敏度、特異性較高對疾病早期診療沒有太大幫助酶聯(lián)免疫吸附法較快速，批量篩查特異性不高，假陽性多分子生物學(xué)方法靈敏度和特異性均很高操作繁瑣，價格昂貴呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第18頁采樣抗原檢測拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。

伸入距離為從耳垂部到鼻尖長度二分之一，普通針對兩周歲以下兒童，伸入距離約為拭子絨毛頭長度兩倍拭子伸入后要輕輕捻動拭子轉(zhuǎn)3圈。

取樣后在一小時之內(nèi)洗脫到生理鹽水中，12小時內(nèi)送檢呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第19頁抗原檢測采樣呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第20頁采樣對結(jié)果影響較大非經(jīng)典感染多為干咳，無痰/少痰陽性率低（標本問題，病毒顆粒小）抗原在體內(nèi)存在時間短抗原檢測劣勢呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第21頁采樣抗體檢測呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第22頁檢測樣本要求

本試劑盒僅適合用于檢測人血清。其血液采集需由專業(yè)人員無菌靜脈穿刺采集。提議使用消毒或無菌技術(shù)，以保持樣本完整性。血清樣本采集后如不在8小時內(nèi)檢測應(yīng)2～8oC冷藏，如7天內(nèi)不檢測，則應(yīng)冷凍（-20oC）保留。不要重復(fù)凍融以預(yù)防免疫球蛋白滴度降低，尤其是IgM。不要使用高血脂或污染血清。若樣本中含有微粒要離心使之澄清。

呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第23頁九項呼吸道病原體IgM抗體檢測試劑呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第24頁九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第25頁常見檢測九種非經(jīng)典病原體嗜肺軍團菌肺炎支原體Q熱立克次體肺炎衣原體腺病毒呼吸道合胞病毒流感病毒(甲型、乙型)副流感病毒呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第26頁嗜肺軍團菌廣泛分布于天然淡水或人工水域，革蘭氏陰性短桿菌易感人群：通常為老年人、兒童、吸煙者、等免疫功效低下者。流行：夏秋季節(jié)。尤其是在裝有中央空調(diào)封閉空間內(nèi)易暴發(fā)。軍團菌肺炎潛伏期為2-10天，癥狀：發(fā)冷、不適、肌痛、頭暈、頭痛，并有煩躁、呼吸困難、胸痛。IgM抗體在感染后1周左右出現(xiàn)，并可連續(xù)存在3-6個月。我國各省市每年都有病例匯報。陽性率2%-5%呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第27頁肺炎支原體肺炎支原體，是介于病毒與細菌之間一個沒有細胞壁病原體經(jīng)14-21天潛伏期開始發(fā)病，患者有頭痛、乏力、無力干咳等癥狀I(lǐng)gM抗體普通在感染后1周出現(xiàn)，3-4周到達高峰，可連續(xù)存在3-6個月學(xué)齡兒童、嬰幼兒、青少年患病較多，兒童中最經(jīng)典綜合癥是氣管支氣管炎，許多成年感染者是無臨床癥狀小區(qū)取得性肺炎患者中由肺炎支原體引發(fā)達40%冬季較多，地域性流行呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第28頁Q熱立克次體Q熱立克次體，，是介于最小細菌和病毒之間一類獨特嚴格在活細胞內(nèi)寄生原核細胞型微生物

病原體儲存于動物中，傳染源主要是受染牛，羊等家畜，在動物間以蜱傳輸。動物感染后多無癥狀，但乳汁，尿，糞中可長久帶有病原體。對人感染力尤其強，是立克次體中唯一可不借助于媒介節(jié)肢動物而經(jīng)過感染動物排泄物污染環(huán)境后，經(jīng)過接觸氣溶膠感染呼吸道。消化道等路徑感染。大部分病例發(fā)于春天或是初夏。其流行行分布全世界，我國吉林、四川、云南、新疆、西藏、廣西、福建、貴州等十幾個省市、自治區(qū)都有本病流行。其潛伏期12～39天，平均18天。IgM抗體普通在感染后2周左右出現(xiàn)，4-8周達高峰，可連續(xù)存在3-4個月。癥狀主要是高熱，猛烈頭痛，寒顫，嚴重乏力，肌痛，且常有胸痛，體溫升高。陽性率1%-2%呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第29頁肺炎衣原體肺炎衣原體是一個比細菌小但比病毒大生物，專性細胞內(nèi)寄生感染方式：人與人可經(jīng)過呼吸道分泌物傳輸8歲以上兒童易被感染，尤其是人群聚集處。肺炎衣原體肺炎占小區(qū)取得性肺炎百分比10%左右多數(shù)起病遲緩，潛伏期30天左右，IgM抗體在發(fā)病2-3周出現(xiàn)，普通來說可連續(xù)存在2-6個月。臨床開始出現(xiàn)流感樣癥狀如咽痛、頭痛、發(fā)燒。陽性率普通在1-5%左右呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第30頁腺病毒腺病毒是一個無外殼雙鏈DNA病毒，其很多與人類上、下呼吸道感染親密相關(guān)。

腺病毒肺炎多發(fā)生于7～24月嬰幼兒。起病時潛伏期2-14天，IgM抗體在發(fā)病1周左右出現(xiàn)，可連續(xù)存在2-3個月。冬春兩季常見，腺病毒肺炎約占病毒性肺炎20%～30%。陽性率：15%-25%，居病毒性肺炎第二位；

呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第31頁呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒是RNA病毒；

呼吸道合胞病毒（RSV）是嬰幼兒下呼吸道感染(包含毛細支氣管炎和肺炎)最主要病因之一，可能是致命性；在年長兒和成年人中也非經(jīng)常見。在冬季暴發(fā)流行。呼吸道合胞病毒感染潛伏期為3-7天，IgM抗體在發(fā)病1周左右出現(xiàn)，可連續(xù)存在2～3個月；占病毒性肺炎25%-35%左右；位居兒童病毒性肺炎第一位；呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第32頁流感病毒流行性感冒病毒是一個造成人類及動物患流行性感冒RNA病毒，呈球形；依據(jù)其核蛋白抗原性能夠分為三類:甲型、乙型、丙型該病毒呈季節(jié)性周期性流行暴發(fā)（12月-4月）甲型流感流行每年都會發(fā)生乙型流感流行只在每3-6年暴發(fā)一次，感染人數(shù)超出總?cè)丝?5%流感病毒潛伏期為1-7天，IgM抗體在發(fā)病1周左右出現(xiàn)，可連續(xù)存在2-3個月呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第33頁副流感病毒經(jīng)常引發(fā)兒童下呼吸道感染一個病毒，其致病性僅次于呼吸道合胞病毒，它是單鏈RNA病毒副流感病毒潛伏期為2-7天，IgM抗體在發(fā)病1周左右出現(xiàn)，可連續(xù)存在2-3個月

副流感病毒感染整年均可發(fā)生，第1和第2型副流感病毒感染常見于幼兒，局部流行發(fā)生于托兒所，兒科病房，小學(xué)及其它兒童場所。第3型為地方性流行，傳染性強陽性率：10%-20%臨床無法做出副流感診療，只能經(jīng)過試驗室檢測來診療呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第34頁病原體潛伏期IgM抗體產(chǎn)生時間病原體潛伏期IgM產(chǎn)生時間Igm存在時間嗜肺軍團菌2-10天1周左右3-6個月肺炎支原體14-21天1周左右3-6個月Q熱立克次體12-19天2周左右3-4個月肺炎衣原體30天左右2-3周2-6個月腺病毒2-14天1周左右2-3個月呼吸道合胞3-7天1周左右2-3個月流感病毒1-7天1周左右2-3個月副流感2-7天1周左右2-3個月呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第35頁抗原抗體檢測IgMIgG呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第36頁檢測原理間接免疫熒光法（IFA）是基于待測樣本中抗體與吸附在載玻片上抗原發(fā)生反應(yīng)。樣本中存在特異性抗體和抗原反應(yīng)，未與抗原結(jié)合免疫球蛋白在洗滌步驟中除去。在下一步驟中，抗原-抗體復(fù)合物與熒光素標識抗人球蛋白反應(yīng)，用免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第37頁試驗步驟1樣本稀釋：血清標本與PBS按1:1百分比稀釋稀釋后血清加入吸附劑中，徹底混勻。處理后血清要離心10-15分鐘除去沉淀，以防干擾檢測呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第38頁試驗步驟2呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第39頁4.顯微鏡觀察病原體形態(tài)或熒光模式嗜肺軍團菌桿狀肺炎支原體細胞外圍熒光模式立克次體球桿狀肺炎衣原體球狀腺病毒混合熒光模式（細胞核和胞漿或胞膜）呼吸道合胞病毒混合熒光模式（細胞核和胞漿或胞膜）甲型流感病毒混合熒光模式（細胞核和胞漿或胞膜）乙型流感病毒混合熒光模式（細胞核和胞漿或胞膜）副流感病毒混合熒光模式（細胞核和胞漿或胞膜）呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第40頁5.結(jié)果判讀1）陽性結(jié)果：能夠觀察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性血清1-15%細胞細胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色合胞）；軍團菌、衣原體或立克次體中全部細菌展現(xiàn)出蘋果綠色熒光；支原體對陽性血清在細胞外圍展現(xiàn)蘋果綠色熒光。呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第41頁

2）陰性結(jié)果：可觀察到軍團菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒細胞展現(xiàn)紅色。呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第42頁嗜肺軍團菌陰性：熒光弱、少、不規(guī)則呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第43頁嗜肺軍團菌陽性：熒光密集，且亮度很好，桿狀形態(tài)呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第44頁肺炎支原體陰性：紅色細胞周圍無或少許熒光，亮度弱呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第45頁肺炎支原體陽性：熒光占視野50%以上，亮度好，形態(tài)為顯著細胞膜或胞漿呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第46頁Q熱立克次體陰性：熒光弱、少、不規(guī)則呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第47頁Q熱立克次體陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，形態(tài)經(jīng)典呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第48頁肺炎衣原體陰性：熒光弱、少呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第49頁肺炎衣原體陽性：熒光密集，且亮度很好呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第50頁腺病毒陰性：熒光弱、少呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第51頁腺病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野陽性細胞>3-5個呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第52頁呼吸道合胞病毒陰性：熒光弱、少呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第53頁呼吸道合胞病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野陽性細胞>3-5個呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第54頁甲型流感病毒陰性：熒光弱、少呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第55頁甲型流感病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野陽性細胞>3-5個呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第56頁乙型流感病毒陰性：熒光弱、少呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第57頁乙型流感病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野陽性細胞>3-5個呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第58頁副流感病毒陰性：熒光弱、少呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第59頁副流感病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野陽性細胞>3-5個呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第60頁總結(jié)1、一卡九項，范圍更廣，不但能夠檢測五項病毒，而且能夠檢測肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌、Q熱立克次體2、檢測IgM抗體，利于早期發(fā)覺，采取間接免疫熒光法，操作簡便，結(jié)果快速3、標本為血清標本，輕易采集、輕易保留4、鏡下熒光形態(tài)清楚，輕易判定5、觀察熒光，準確性好6、準確檢測出哪種病原體感染，能為臨床診療、治療提供強有力幫助呼吸道九聯(lián)檢病原體檢測及其臨床意義專家講座第61頁臨床問題總結(jié)1、查到病毒陽性臨床意義大不大？病毒性呼吸道感染雖屬于自限性疾病，主要引發(fā)上呼吸道疾病，但含有較強傳染性，而且可引發(fā)嚴重并發(fā)癥病毒性呼吸道感染疾病預(yù)后取決于病毒類型和宿主對病毒反應(yīng)臨床主要依