南美白對蝦蝦頭中蝦青素的提取工藝及穩(wěn)定性張靖;商建偉;賀瑤;王連杰;李鈺金;胡增淼;林洪;毛相朝【摘要】以嗜熱鏈球菌發(fā)酵蝦頭后的固體產(chǎn)物為原料提取蝦青素，研究了乙醇提取純化蝦青素的條件，并對所提取的蝦青素的穩(wěn)定性進行了分析.實驗結(jié)果表明，最優(yōu)提取條件為用乙醇以固液比1：6(m/V)于30°C下提取60min.最優(yōu)皂化方案為1mol/L的氫氧化鈉甲醇皂化液在4C下恒溫皂化12h.以正己烷、二氯甲烷和丙酮(5:2:2,V/V/V)為流動相過柱純化,可以得到較優(yōu)的蝦青素純品.蝦青素提純液在高溫下不穩(wěn)定;對日光或紫外光不穩(wěn)定，對室內(nèi)光或避光較穩(wěn)定;Mg2+、Na+和Ca2+對蝦青素的破壞較小,Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對蝦青素的破壞較為嚴重;VE、Na2SO3和Vc對蝦青素都有一定的保護作用，其中VE的保護作用最為明顯.本研究優(yōu)化了從南美白對蝦中回收蝦青素的方法，對其他甲殼類下腳料的綜合利用具有—定的參考價值.【期刊名稱】《中國漁業(yè)質(zhì)量與標準》【年(卷)，期】2014(004)001【總頁數(shù)】10頁(P43-52)【關鍵詞】蝦青素;提純;穩(wěn)定性;蝦頭;嗜熱鏈球菌【作者】張靖;商建偉;賀瑤;王連杰;李鈺金湖增淼;林洪;毛相朝【作者單位】中國海洋大學食品工程與科學學院,山東青島266003;中國海洋大學食品工程與科學學院,山東青島266003;中國海洋大學食品工程與科學學院,山東青島266003;中國海洋大學食品工程與科學學院仙東青島266003;泰祥集團仙東省海洋食品營養(yǎng)研究院,山東榮成264309;泰祥集團,山東省海洋食品營養(yǎng)研究院,山東榮成264309;中國海洋大學食品工程與科學學院仙東青島266003;中國海洋大學食品工程與科學學院,山東青島266003【正文語種】中文［中圖分類】S98蝦青素（astaxanthin,3,3‘-二羥基-4,4'-二酮基書邛’-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4）是發(fā)現(xiàn)于包括蝦在內(nèi)的許多水生動物體內(nèi)的一種類胡蘿卜素［1］，呈艷麗紅色，為脂溶性，具有高效抗氧化、抗癌變和增強免疫等功能［2-3］。經(jīng)調(diào)查，目前天然的蝦青素市場價格為1600元/g，市場上供不應求，應用前景十分廣闊。中國蝦類資源極為豐富，多用于加工蝦仁粗產(chǎn)品，并冷凍出口。在加工生產(chǎn)過程中，占蝦體重30%~40%的蝦頭將被剔除，據(jù)報道，每年生產(chǎn)蝦頭下腳料50萬t以上［4-7］。在之前的研究中，蝦頭廢物的利用具有局限性，主要由于它易腐爛，并且生產(chǎn)受季節(jié)性限制，產(chǎn)品在使用之前通常會發(fā)生分解。所以大部分廢物被丟棄或者用酸堿處理，造成了資源浪費和環(huán)境污染問題［8］。探索環(huán)保節(jié)能的回收蝦青素的方法，對甲殼類加工下腳料的綜合利用具有重要的意義。目前從甲殼類下腳料中提取蝦青素的方法主要有以下4種:堿提法、油溶法、有機溶劑法以及超臨界CO2流體萃取法。堿提法主要是運用堿液脫蛋白的原理，當用熱堿液處理甲殼類下腳料時，可將結(jié)合的蛋白質(zhì)和蝦青素水解出來，從而達到提取蝦青素的目的［9］。油溶法是根據(jù)蝦青素良好的脂溶性這一特性進行的［9］。油提取的溫度一般較高（60~90。0,高溫會影響蝦青素的穩(wěn)定性，另夕卜提取后含色素的油不易濃縮，產(chǎn)品濃度不高，應用范圍受到限制。有機溶劑是提取蝦青素的有效試劑，提取后可將溶劑蒸發(fā)，進而濃縮蝦青素，得到濃度較大的蝦青素油。同時溶劑也可回收循環(huán)利用。常見的溶劑有丙酮、乙醚、乙醇、氯仿、石油醚和正己烷等，其中丙酮的提取效果最佳［10-11］。但是像丙酮等這類有機溶劑，易揮發(fā)，沸點低，且有一定的毒性，加工過程中存在健康與安全問題，在實際應用中受到一定的限制。超臨界流體萃取技術是近幾年發(fā)展起來的高新技術，其可以得到高品質(zhì)的產(chǎn)品。但由于設備前期投資大、成本高和生產(chǎn)技術要求高，目前用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)尚存在一定的困難［10］。本研究利用嗜熱鏈球菌發(fā)酵蝦頭下腳料，以發(fā)酵后產(chǎn)物為原料。利用無毒可回收的乙醇提取蝦青素，探索提取純化方法并將其進行優(yōu)化。研究各種因素對其穩(wěn)定性的影響。以最優(yōu)提取純化方案獲取蝦青素并尋求合理的貯藏條件，減少再利用過程中色素的損失。1材料與方法1.1原料與預處理新鮮南美白對蝦（Litopenaeusvannamei）蝦頭來自于海南高遠食品有限公司。將新鮮蝦頭切碎至2~10mm，冷藏備用。嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）菌株（本實驗室保藏），用MRS培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24h。發(fā)酵條件如下:以總重量為100%計，10%蝦頭中加入5%葡萄糖，接種量5%，蒸餾水80%,42°C發(fā)酵60h。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液離心取固體部分，保藏備用。1.2試劑與儀器除高效液相色譜流動相為色譜純外，其他試劑均為分析純，水為蒸餾水;蝦青素（Sigma）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE52—99，上海亞榮生化儀器廠）;循環(huán)水式多用真空泵（SHB—I,鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；電子天平（PC230，梅特勤托利多儀器）;高速離心機（TCL,長沙英泰儀器有限公司）;恒溫搖床（KHY-10，長沙湘儀離心機儀器）;高效液相色譜儀（AgilentTechnologies1260Infinity）。2實驗方法2.1實驗流程圖南美白對蝦蝦頭素的提取工藝見圖1。圖1實驗流程圖Fig.1Flowdiagramoftheprocess2.2蝦青素提取方法的確定選取不同的提取技術，對經(jīng)過發(fā)酵處理（方法見1.1）的蝦殘留固體進行處理，通過比較提取后的收率和提取質(zhì)量，選取最優(yōu)的提取方法。所有提取方法所用的提取試劑均為無水乙醇。2.2.1索氏提取法稱取15g發(fā)酵后固體（分為3份，每份5g），用濾紙包好后裝入250mL索氏提取器，依次加入200mL無水乙醇，80°C水浴中各回流24h，利用高效液相色譜法檢測提取液中蝦青素含量，取3份的平均值，并計算提取率［12］。2.2.2超聲法2.2.2.1超聲時間的單因素實驗保持其他條件不變的情況下，超聲提取10、30、50、70和90min。利用高效液相色譜法檢測提取液蝦青素含量，取3份的平均值，并計算蝦青素得率。確定最適的提取時間。2.2.2.2超聲提取次數(shù)的單因素實驗保持其他條件不變的情況下，用最適提取時間超聲提取直到提取液為無色，利用高效液相色譜法檢測提取液蝦青素含量。取3份的平均值，并計算蝦青素得率。確定最適的提取次數(shù)。2.2.2.3超聲法提取稱取15g發(fā)酵后固體（分為3份，每份5g）,用無水乙醇浸泡，固液比為1：20（m/V），超聲波的頻率為40kHz。超聲波提取2次，每次超聲波提取50min,提取溫度為25°C［13］。超聲結(jié)束后取提取液，利用高效液相色譜法檢測提取液蝦青素含量，取3份的平均值，并計算提取率。2.2.3加熱浸泡法2.2.3.1加熱提取次數(shù)的單因素實驗稱取15g發(fā)酵后固體(分為3份，每份5g),用無水乙醇以固液比1:6(m/V)在45C下浸泡1h，連續(xù)提取4次，利用高效液相色譜法分別檢測每次提取液蝦青素含量，取3份的平均值，并計算蝦青素得率。2.2.3.2加熱浸泡法提取稱取15g發(fā)酵后固體(分為3份，每份5g),用無水乙醇以固液比1:6(m/V)在45C下浸泡1h，重復提取2次，合并提取液。利用高效液相色譜法檢測提取液蝦青素含量［14］，取3份的平均值，并計算提取率。2.3優(yōu)化提取方法經(jīng)過上述實驗，得出加熱浸泡法效果最佳。通過正交實驗法優(yōu)化，以確定最適提取時間、提取溫度和固液比。正交試驗的浸提溫度選擇30、45和60C;浸提時間選擇30、45和60min;固液比選擇1:3(m/V)、1:6(m/V)和1:9(m/V);每組實驗重復3次，提取結(jié)果利用高效液相色譜法進行分析，取平均值。2.4蝦青素的純化優(yōu)化2.4.1皂化反應將提取溶液濃縮后加入等體積甲醇，再加入氫氧化鈉-甲醇溶液充氮后低溫皂化一定時間，再在常溫下放置2h左右。皂化后的溶液加入等體積蒸餾水和二氯甲烷，液液萃取，離心，將下層有機相取出，再用蒸餾水洗2次以上，洗至pH中性為止，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10mL,待過柱。2.4.2優(yōu)化皂化反應條件綜合堿濃度、皂化溫度和皂化時間對皂化結(jié)果的影響［15-16］,設計正交實驗，確定最佳皂化工藝。皂化堿濃度選擇0.5、1.0和1.5mol/L，皂化溫度選擇4、10和16°C，皂化時間選擇4、8和12h。收集得到不同二氯甲烷相，用高效液相色譜法測定其游離的蝦青素濃度。比較不同皂化工藝得到的游離蝦青素含量，以最高的為最優(yōu)皂化條件。2.4.3原料對照采用未發(fā)酵的蝦頭為原料，利用最優(yōu)的提取條件和最適的皂化工藝獲得蝦青素，用高效液相色譜法測定游離的蝦青素濃度。2.4.4薄層層析法選取最優(yōu)流動相用玻璃毛細點樣管將樣品溶液點到薄層硅膠板下端距邊緣約1.0cm處，待樣品溶液干后，將薄層板斜放到裝有少量展開劑的層析缸中展開。等到展開劑前沿接近硅膠板上端，拿出硅膠板，放在空氣中，待展開劑揮發(fā)，目視。通過對不同極性的溶劑介質(zhì)展開效果和展開時間的比較，選擇最優(yōu)的流動相。本實驗設計了4組有機試劑組合:二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮-二氯甲烷、石油醚-丙酮、正己烷-乙醚。根據(jù)溶劑不同體積比調(diào)節(jié)展開劑的極性強弱，通過不同極性強弱的展開劑對同—種樣品展開效果即比移值(Rf)和分離的樣品個數(shù)進行比較，從而選出最好的展開劑方案［17］。2.4.5柱層析分離純化取80g300~400目硅膠，預先用洗脫液浸泡過夜。填柱后，上樣10mL勻速洗脫過柱。收集蝦青素層。2.5蝦青素的穩(wěn)定性研究［18-19］2.5.1光源對蝦青素溶液穩(wěn)定性的影響取以乙醇為溶劑的蝦青素提純?nèi)芤焊?mL,分別置于太陽光可照射處、紫外光可照射處、室內(nèi)自然光可照射處、燈光可照射處以及完全避光處。靜置12h后，測蝦青素含量。3次重復，取平均值并計算留存率。2.5.2溫度對蝦青素油溶液穩(wěn)定性的影響取用乙醇為溶劑的蝦青素提純?nèi)芤焊?mL,分別置于10、20、30、40、50、60、70和80°C下避光恒溫水浴鍋5h。測蝦青素含量。3次重復，取平均值并計算留存率。2.5.3金屬離子對蝦青素油溶液穩(wěn)定性的影響取用乙醇為溶劑的蝦青素提純?nèi)芤焊?mL,分別加入1mgMg2+、Na+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+金屬離子的硫酸鹽。振蕩混合，室溫(20C)下置于室內(nèi)陰暗處，2d后測蝦青素含量。3次重復，取平均值并計算留存率。2.5.4還原劑對蝦青素溶液穩(wěn)定性的影響取用乙醇為溶劑的蝦青素提純?nèi)芤焊?mL,分別以30和60mg/mL的添加量加入Na2SO3、VC和VE。室溫避光下保存2d測蝦青素含量。3次重復，取平均值并計算留存率。2.5.5留存率的測定2.6高效液相色譜法采用高效液相色譜法［20］檢測蝦青素的含量。色譜條件:反相C18色譜柱(AgilentTechnologies,218TP54,250mmx4.6mm),流動相為甲醇和乙腈(3:1,V/V)，流速1mL/min，檢測波長476nm,柱溫251,進樣量20pLo3結(jié)果與討論3.1標準曲線用吸管準確吸取1mL質(zhì)量濃度為0.1~0.8mg/L的蝦青素標準液，共8個濃度點，放于25mL比色管中，用蒸餾水稀釋至10mL刻度線，之后用1cm比色皿,用各自濃度的NaOH作為參比液，在最佳波長475nm下測浸取液的吸收峰面積。以蝦青素質(zhì)量濃度為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標繪制出蝦青素的標準曲線（圖2）。圖2蝦青素標準曲線Fig.2Calibrationcurveofastaxanthin3.2蝦青素提取方法的優(yōu)化3.2.1超聲時間單因素實驗結(jié)果把蝦青素得率最高的值設為100%。由圖3可知，在50min之前，蝦青素未能充分地轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著提取時間增加，蝦青素含量呈逐漸上升趨勢，在50min時蝦青素含量達到最高。之后，隨著超聲時間的增加，蝦青素含量呈明顯下降的趨勢。實驗在綜合考慮各因素的條件下，采用超聲法提取蝦青素時，選擇50min作為最佳提取時間。圖3超聲時間對蝦青素提取率的影響Fig.3Effectofultrasonictimeonastaxanthinextraction3.2.2超聲提取次數(shù)單因素實驗結(jié)果把5次提取的總和設為100%，由圖4可知，提取2次就可得97.2%的蝦青素，提取3次僅多得到2.8%蝦青素，而且浪費試劑，增加成本。實驗在綜合考慮的因素下，采用超聲法提取蝦青素時，選擇提取2次為最佳。3.2.3加熱提取次數(shù)的單因素實驗結(jié)果把4次提取的總和設為100%。由圖5可知，第1次即可大部分提取出蝦青素，第2次還可提高20%，第3次提取1h蝦青素得率只提高7%，效率偏低。綜合考慮各因素，采用加熱浸泡法提取蝦青素時，選擇提取2次為最佳。圖4超聲提取次數(shù)對蝦青素提取的影響Fig.4Effectofultrasonicextractiontimesonastaxanthinextraction圖5加熱提取次數(shù)對蝦青素提取的影響Fig.5Effectofheatingtimesonastaxanthinextraction3.2.4蝦青素提取的優(yōu)化根據(jù)不同萃取方法所獲得的蝦青素提取量，結(jié)果見表1。用乙醇加熱浸泡發(fā)酵后固體所提取的蝦青素含量比其他方法高出許多，而且更加節(jié)省時間和乙醇用量。此外，用索氏提取法提取發(fā)酵后固體中的蝦青素，萃取后提取液中并未檢測出蝦青素，推測原因是索氏提取所用的高溫降解了蝦青素，所以液相測不出蝦青素的含量。說明索氏提取法并不適用于乙醇提取蝦頭發(fā)酵后固體中的蝦青素，根據(jù)表1中列出的提取方法，獲得相當質(zhì)量的提取物（高值的蝦青素），可知蝦頭是一種獲得蝦青素的合適原料。表1不同萃取方法所獲得的蝦青素提取量Tab.1Astaxanthincontentobtainedbydifferentextractiontechniques*注："一"表示未測出蝦青素，下同。萃取方法Extractionmethod液固比/（mL-g-1）Liquid-Solidratio提取時間/hExtractiontime提取次數(shù)Extractiontimes蝦青素含量/（pg-g-1蝦頭）Astaxanthincontent索氏提取20241—加熱浸泡61217.19超聲205/6211.50為最大限度地獲取蝦青素，優(yōu)化提取技術是非常重要的。從表1可以看出，加熱浸泡的效果最佳。為進一步獲取最優(yōu)提取方法，通過正交設計法優(yōu)化乙醇浸泡法，以溫度、固液比和時間為考察因素，每個因素設計3個水平，以每g蝦頭中蝦青素的提取量為考察指標，正交實驗結(jié)果如表2所示。固液比、溫度和時間分別用A、B和C表示，按順序輸入相應數(shù)值，進行優(yōu)化分析，結(jié)果如表3所示。表2乙醇浸泡提取蝦青素正交優(yōu)化實驗Tab.2Orthogonaloptimizationresultsofastaxanthinextractionbyethanol實驗編號No.溫度/QCTemperature固液比/（g-mL-1）Solid-liquidrati。提取時間/hExtractiontime蝦青素含量/（pg-g-1蝦頭）Astaxanthincontent1301:33017.12451:36017.63601:34515.84301:66021.65451:64518.36601:63016.97301:94521.78451:93017.69601:96021.7表3乙醇浸泡提取蝦青素正交實驗優(yōu)化分析Tab.3Orthogonaloptimizationanalysisofastaxanthinextractionbyethanol95%置信區(qū)間組另UGroups蝦青素含量/(pg-g-1蝦頭)Astaxanthincontent標準偏差Standarddeviation95%confidenceintervals最小值Min最大值MaxA1:316.8330.35115.32218.3441:618.9330.35117.42220.4441:920.3330.35118.82221.844B30°C20.1330.35118.62221.64445°C17.8330.35116.32219.34460°C18.1330.35116.62219.644C30min17.2000.35115.68918.71145min18.6000.35117.08920.11160min20.3000.35118.78921.811表3顯示了各因素不同水平的平均值。從結(jié)果直觀分析，各因素水平對結(jié)果影響的強弱順序是A3>A2>A1,B1>B3>B1,C3>C2>C1。同時方差分析結(jié)果顯示，各因素對實驗結(jié)果的影響主次分別為A>C>B。數(shù)據(jù)分析確定最佳工藝為A3B1C3，且該組與A2B1C3實驗結(jié)果相近，但是后者能夠在相近的蝦青素提取量上減少乙醇的使用。綜上所述，選擇A2B1C3為實驗提取組，即最優(yōu)提取方案為用乙醇以固液比1:6(m/V)在30C下提取60min，重復操作2次，合并提取液。3.3蝦青素的純化優(yōu)化3.3.1皂化反應條件的優(yōu)化以加入蝦青素提取濃縮液的堿濃度、皂化時間和皂化溫度為考察因素，每個因素設計3個水平，以皂化后蝦青素皂化液的含量作為考察指標，設計正交實驗，結(jié)果如表4所示。處理因素堿濃度、皂化時間和造化溫度分別用A、B和C表示，按順序輸入相應數(shù)值，建立數(shù)據(jù)庫。結(jié)果如表5所示。表4皂化反應條件正交優(yōu)化實驗Tab.4Orthogonalexperimentresultsofthesaponificationreactionconditionsoptimization實驗編號No.堿濃度/（mol-L-1）Alkaliconcentration皂化時間/hSaponificationtime皂化溫度/^Saponificationtemperature蝦青素含量/（pg-g-1蝦頭）Astaxanthincontent10.541626.2921.04422.9631.54101.2740.58102.9951.0816—61.5842.5870.512436.5781.0121049.0691.512165.58表5堿濃度、皂化時間和皂化溫度對蝦青素影響Tab.5Theinfluenceofalkaliconcentration,saponificationtimeandtemperatureuponastaxanthin95%置信區(qū)間組別Groups蝦青素含>/（pg-g-1蝦頭）Astaxanthincontent標準偏差Standarddeviation95%confidenceintervals最小值Min最大值MaxA0.521.9838.381-14.08758.045124.0078.381-12.05560.0681.53.1438.381-32.98139.205B4h16.8408.381-19.22252.9028h1.8578.381-34.20537.91812h30.4378.381-5.62566.498C4°C20.7378.381-15.32556.79810C17.7738.381-18.28853.83516C10.6238.381-25.43846.685由表5直觀分析，各因素水平的優(yōu)劣順序是A2>A1>A3,B3>B1>B2,C1>C2>C3。同時方差分析結(jié)果顯示，各因素對實驗結(jié)果的影響主次分別為B>A>C。數(shù)據(jù)分析確定最優(yōu)實驗組合為B3A2C1，即皂化的最佳工藝條件為:1mol/L的氫氧化鈉甲醇皂化液在4C下恒溫皂化12h。采用有機溶劑法提取蝦青素時，不同的溶劑提取效果不同，采用乙醇提取的提取率是最低的。本研究優(yōu)化乙醇提取工藝后，每kg蝦頭提取蝦青素量為21.6mg，優(yōu)化皂化條件后，每kg蝦頭提取率上升到49.1mg。雖然比其他溶劑和超臨界萃取方法要低，但是與文獻［14］相比，提取率已有較大提高。3.3.2原料對照的結(jié)果用高效液相色譜法測得蝦青素含量為10.041pg/g,是發(fā)酵后的蝦頭提取蝦青素量49.06pg/g的20%，可得知蝦頭經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，蝦青素更容易被提取。3.3.3薄層層析法選取最優(yōu)流動相根據(jù)溶劑不同體積比來調(diào)節(jié)展開劑的極性強弱，通過展開劑的不同極性強弱對蝦青素樣品的分離效果即比移值(Rf)和分離的樣品個數(shù)進行比較，從而選出最好的展開劑方案。通過調(diào)節(jié)的比例，選出最優(yōu)的展開劑方案，即正己烷-二氯甲烷-丙酮的比例為5:2:2(V/V/V)時展開效果最優(yōu)。如圖6可以看出蝦青素標準品的比移值，其計算公式見式(2)。圖6薄層層析分析1:蝦青素標準品;2:乙醇提取發(fā)酵后蝦頭固體樣品。Fig.6TLCanalysis1:Astaxanthinstandard;2:Ethanolextractionofthesolidresidueafterfermentation.3.4液相色譜結(jié)果HPLC法對樣品中游離蝦青素的檢測結(jié)果如圖7所示。根據(jù)游離蝦青素標準樣品的HPLC色譜圖(圖7A)可知出峰時間為2.94min左右的峰是游離蝦青素。從圖7C中的色譜峰可以看出，蝦青素提取液經(jīng)過皂化提純之后，色譜圖中的雜峰明顯比粗提液中的少，與蝦青素標準品的譜圖接近一致。圖7液相色譜圖A:蝦青素標準品圖譜;B:乙醇粗提取蝦青素圖譜；C:蝦青素提取物提純后譜圖。Fig.7HPLCchromatogramA:HPLCchromatogramofastaxanthinstandard;B:HPLCchromatogramofastaxanthinbyethanolextraction;C:HPLCchromatogramofpurifiedastaxanthin.3.5蝦青素穩(wěn)定性研究3.5.1光源對蝦青素穩(wěn)定性的影響從圖8A中可以看出，紫外光和太陽光對蝦青素的影響最為劇烈，連續(xù)照射12h后蝦青素留存率分別為51.49%和50.27%;燈光下蝦青素也有一定的損失，留存率為87.49%。室內(nèi)自然光和避光條件對蝦青素幾乎沒有影響?？梢姽庹湛蓪е挛r青素的降解，故蝦青素的處理、保存，應盡可能在避光狀態(tài)下操作。圖8各種環(huán)境因素對蝦青素穩(wěn)定性的影響A:光照對蝦青素穩(wěn)定性的影響;B:還原劑對蝦青素穩(wěn)定性的影響;C:金屬離子對蝦青素穩(wěn)定性的影響;D:溫度對蝦青素穩(wěn)定性的影響。Fig.8EffectofconditionsonastaxanthinstabilityA:Effectoflightresourceonastaxanthinstability;B:Effectofreducingagentsonastaxanthinstability;C:Effectofmetaliononastaxanthinstability;D:Effectoftemperatureonastaxanthinstability.3.5.2還原劑對蝦青素穩(wěn)定性的影響從圖8B可以看出，往蝦青素提取液中加入VE、Na2SO3和VC等還原劑對提高蝦青素穩(wěn)定性都有一定的作用，且隨著添加量的增加，蝦青素的穩(wěn)定性增強。其中VE提高蝦青素穩(wěn)定性的效果最明顯，可見VE對蝦青素有較好的保護作用。3.5.3金屬離子對蝦青素穩(wěn)定性的影響由圖8C可知，Mg2+、Na+和Ca2+雖對蝦青素的穩(wěn)定性有一定的影響，但影響較小，放置2d后留存率基本都在70%以上。Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對蝦青素影響較大，尤其是Fe2+對蝦青素影響最大，蝦青素被完全破壞。所以在蝦青素制取和保存過程中應盡可能地避免與Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+這些金屬離子接觸。3.5.4溫度對蝦青素穩(wěn)定性的影響由圖8D分析可得，溫度低于40°C時對蝦青素影響不大，蝦青素留存率均接近100%，蝦青素損失較小。隨著溫度升高，蝦青素留存率逐漸下降。80C下加熱5h后，蝦青素含量損失一半以上。說明從嗜熱鏈球菌發(fā)酵后的蝦頭中提取的蝦青素在40C以下比較穩(wěn)定。4結(jié)論實驗結(jié)果顯示，影響蝦青素提取的主要條件為固液比、提取時間和溫度。通過正交試驗確定了蝦青素最佳提取條件為:用乙醇以固液比1:6在30°C下提取60min,重復操作2次，合并提取液，提取量可達到21.6pg/g蝦頭。蝦青素的最優(yōu)皂化條件為將提取溶液濃縮，加入等體積甲醇后，再加入1mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，充氮后低溫皂化12h，再在常溫下放置2h左右。皂化后的溶液加入等體積蒸餾水和二氯甲烷，液液萃取，離心，將下層有機相取出，再用蒸餾水洗2次以上，洗至pH中性為止，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10mL的體積后，以正己烷、二氯甲烷和丙酮(5:2:2,V/V/V)為流動相過柱純化。蝦青素提取液在高溫下不穩(wěn)定;對日光或紫外光不穩(wěn)定，對室內(nèi)光或避光較穩(wěn)定；Mg2+、Na+和Ca2+對蝦青素的破壞較小，Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對蝦青素的破壞較為嚴B；VE.Na2SO3和VC對蝦青素都有一定的保護作用，VE的保護作用最為明顯。本研究為蝦頭中蝦青素的提取、保存和應用提供了一定的理論基礎。參考文獻：[1]MeyersSP,BlighD.Characterizationofastaxanthinpigmentsfromheat-processedcrawfishwaste[J].JAgrFoodChem,1981,29(3):505-508.[2]ChewBP,ParkJS.Carotenoidactionontheimmuneresponse[J].JNutr,2004,134(1):257-261.[3]PalozzaP,TorelliC,BoninsegnaA,etal.Growth-inhibitoryeffectsoftheastaxanthin-richalga(Haematococcuspluvialis)inhumancoloncancercells[J].CancerLett,2009,283(1):108-117.[4]SachindraNM,BhaskarN,MahendrakarNS.CarotenoidsindifferentbodycomponentsofIndianshrimps[J].JSciFoodAgr,2005,85(1):167-172.[5]RaoM,MunozJ,StevensW.Criticalfactorsinchitinproductionbyfermentationofshrimpbiowaste.[J]ApplMicrobiolBiot,2000,54(6):808-813.[6]李來好，王道公，吳燕燕.蝦頭的加工利用[J].湛江海洋大學學報，1995(1):102-105.[7]DuanS,LiL,ZhuangZ,etal.Improvedproductionofchitinfromshrimpwastebyfermentationwithepiphyticlacticacidbacteria[J].CarbohydPolym,2012,89(4)