白血病分子診療技術(shù)康圣環(huán)球醫(yī)學特檢集團周榮白血病分子診療技術(shù)專家講座第1頁WH0血液腫瘤分類方案（1999年）新分類方案基本標準是：結(jié)合形態(tài)學、免疫表型、遺傳改變和臨床特征來判定疾病“真實本質(zhì)”。提供了疾病分類與治療選擇和預(yù)后判斷較明確關(guān)聯(lián)性，開啟了血液腫瘤靶向性治療和個性化方案新時代。形態(tài)學免疫學細胞遺傳學白血病分子診療技術(shù)專家講座第2頁WH0血液腫瘤分類方案（年）組織蛋白細胞基因白血病分子診療技術(shù)專家講座第3頁白血病分子診療意義準確診療準確預(yù)后指導(dǎo)治療科研資料白血病初發(fā)MICM診療系統(tǒng)診療異常標識殘留監(jiān)測靶向治療白血病分子診療技術(shù)專家講座第4頁WHO血液腫瘤新分類試驗技術(shù)平臺實施WHO血液腫瘤新分類方案高度依賴流式細胞、細胞遺傳和分子生物學試驗技術(shù)平臺以及更為主要掌握這類試驗技能并含有血液腫瘤專業(yè)知識血液病理學醫(yī)師。遺傳工作站流式細胞基因平臺白血病分子診療技術(shù)專家講座第5頁基因檢測

——融合基因基因突變白血病分子診療技術(shù)專家講座第6頁“二次打擊”學說D.GaryGillilandBestPractice&ResearchClinicalHaematology.;16:409-417基因突變?nèi)诤匣虬籽“l(fā)生白血病分子診療技術(shù)專家講座第7頁CMLIndicationsforDiagnosticTestsMilestonesandMonitoringinPatientswithCMLTreatedwithImatinib(ASHEducationProgramBookp420)Test Indication PhysicalExam Diagnosis/Staging Everythreemonthuntilresolutionofsplenomegaly SuspectedprogressionorresistanceCompleteBloodCount Diagnosis/Staging Every1-2weeksuntilbloodcounthavestabilized,thenat6weeksintervals SuspectedprogressionorresistanceBoneMarrowKaryotyping Diagnosis/Staging 6,12,18monthsoruntilcompletecytogeneticresponse SuspectedprogressionorresistanceQuantitativePCRforBcr-AblEverythreemonthsonceCCyR(completecytogeneticresponse) documentedFISHforBCR-ABL UncertainDiagnosis(typicalclinicalpresentation,butmetaphase(peripheralblood) cytogeneticsnotsuccessful,orPhchromosomenegative) Every3monthsifnoaccesstohighquantitativePCRmonitoringQualitative(lowsensitivity) UncertainDiagnosis(typicalclinicalpresentation,butmetaphasePCRforBCR-ABL cytogeneticsnotsuccessful,orPhchromosomenegative)BCR-ABLKinaseMutationScreenSuspectedprogressionorresistance

白血病分子診療技術(shù)專家講座第8頁MolecularMeasurementsofTreatmentResponse—ClinicalApplication(ASHEducationProgramBookp367)

Application Action

Detectpoorearlytreatmentresponse Treatmentintensification

Detectgoodearlytreatmentresponse Treatmentdeintensification

Detectrelapse Treatmentintensification PrepareforHSCT MeasureMRDbeforeHSCT OptimizetimingofHSCTMeasureMRDafterHSCT Modulateimmunosupression DLI,etc.MeasureMRDatendofclinicaltrial Evaluatetheresultofnovelanti- ALLagentsortherapy

白血病分子診療技術(shù)專家講座第9頁分子診療在白血病診療中應(yīng)用提供早期輔助診療及預(yù)后判斷對治療過程進行跟蹤進行白血病治療后微小殘留檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第10頁各病例中詳細應(yīng)用AMLCML

ALLCLL

淋巴瘤白血病分子診療技術(shù)專家講座第11頁AML病例中應(yīng)用t(8;21)(q22;q22)AML1-ETOt(15;17)(q22;q21)PML-RARainv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11AML融合基因全套檢測FLT3基因突變檢測NPM1基因突變檢測c-kit/D816V突變檢測CEBPA基因突變檢測WT1基因表示定量檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第12頁t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO融合基因t(8;21)出現(xiàn)在大約7%AML病例中，在年青患者中更為常見。其主要出現(xiàn)在AML-M2這一亞型中，大約有20-40%病例含有t(8;21)。AML1-ETO融合基因出現(xiàn)在全部t(8;21)陽性AML中，同時也出現(xiàn)在含有復(fù)雜易位t(8;21)陰性AML病例中。t(8;21)易位是一個很好標志。白血病分子診療技術(shù)專家講座第13頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第14頁PML-RARα

APL是一類臨床兇險急性白血病，常見廣泛嚴重出血，以顱內(nèi)出血最為嚴重。1、t（15;17)，是APL特有遺傳學標志。（70%-90%APL存在）2、因為PML基因上融合位點不一樣，分為bcr1(55%)、bcr2(4%)、bcr3(40%)三種融合型。3、PML-RARa融合基因（+）患者，可使用全反式維甲酸并提醒預(yù)后復(fù)發(fā)。該基因陽性病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留檢測。白血病分子診療技術(shù)專家講座第15頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第16頁inv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11融合基因Inv(16)(p13;q22)或t(16;16)(p13;q22)通常見于AML-M4Eo亞型，占總AML患者10%。inv(16)(p13;q22)病人通常有很好預(yù)后。白血病分子診療技術(shù)專家講座第17頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第18頁AML相關(guān)基因全套篩查MLL/AF6MLL/AF9MLL/AF10MLL/AF17MLL/ELLdupMLLAML1/ETOPML/RARaPLZF/RARaNPM/RARaCBFB/MYH11NPM/MLF1TLS/ERGDEK/CANEVI1Hox11白血病分子診療技術(shù)專家講座第19頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第20頁基因突變檢測

——AML患者預(yù)后判斷

C-Kit、FLT3、NPM1、CEBPA染色體核型正常AML患者CEBPA(15%)白血病分子診療技術(shù)專家講座第21頁MolecularMarkersadditionaltocytogeneticswithindependentprognosticsignificancesasregardingremissiondurationorsurvivalinAMLofadultsAML:ChallengeofCapturingDieseaseVariety(ASHEducationProgramBookp3)Prognosis Gene Genemutationwith CEPBAmutfavorableimpact NMP1mutbutFLD3-ITDnegGenemutationwith KITunfavorableimpact FLD3-ITDbutnoNMP1mut MLL-PTD*(5-10%ofnormalkaryotypeAML) WT-1*

*amongnormalkaryotypeAML

白血病分子診療技術(shù)專家講座第22頁預(yù)后判斷基因突變好CEBPA（+）FLT3（-）/NPM1（+）差FLT3（+）/NPM1（-）C-Kit（+）AML患者4種基因突變檢測小結(jié)白血病分子診療技術(shù)專家講座第23頁WT1定量檢測

——MDS/AML監(jiān)測指標WT1基因在AML和MDS病人中經(jīng)常異常高表示，與AML和MDS發(fā)生和進展，以及兇險判斷，療效跟蹤和預(yù)后復(fù)發(fā)判斷有非常親密關(guān)系。經(jīng)過定量PCR檢測WT1表示能夠有利于AML和MDS病人風險判斷，療效跟蹤和預(yù)后復(fù)發(fā)判斷。白血病分子診療技術(shù)專家講座第24頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第25頁WT1在正常標本和AML病例中表示情況正常骨髓患者骨髓白血病分子診療技術(shù)專家講座第26頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第27頁基因檢測——CMPD診療CMPD相關(guān)異常（外周血象、骨髓象）陰性陽性JAK2基因突變陰性陽性PV、ET、CMFHES/CEL、SMCML診療可能BCR/ABL融合基因（FISH、PCR）白血病分子診療技術(shù)專家講座第28頁

在WHO分類系統(tǒng)中，將有沒有JAK2突變列為主要診療指標：

假如JAK2突變陽性，血紅蛋白增加，骨髓紅系細胞顯著增加，就能夠診療真性紅細胞增多癥（PV），即使患者就診時血紅蛋白低于以往WHO所要求指標值，但卻連續(xù)超出正常值20g/l，也能夠確診PV。假如JAK2突變陽性，血小板僅僅連續(xù)大于450*109/L，骨髓巨核細胞增生，能夠診療原發(fā)性血小板增多（ET）。PV/ET診療白血病分子診療技術(shù)專家講座第29頁FIP1L1-PDGFRA部分高嗜酸性粒細胞綜合征（HES）患者含有FIP1L1-PDGFRA融合基因，F(xiàn)IP1L1-PDGFRA有連續(xù)活化酪氨酸激酶活性，對酪氨酸激酶抑制劑非常敏感，可用格列衛(wèi)治療。ETV6-PDGFRB有少部分CMPD病例（BCR-ABL陰性）PDGFRB基因連續(xù)性活化表示，格列衛(wèi)能夠特異性抑制ETV6-PDGFRB酪氨酸激酶活性，攜帶該融合基因CMPD病例能夠選擇格列衛(wèi)治療。白血病分子診療技術(shù)專家講座第30頁CML病例中應(yīng)用BCR-ABL融合基因檢測：t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLp210t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLp230BCR-ABL融合基因ABL激酶突變檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第31頁BCR-ABL融合基因超出95%CML病例中存在BCR-ABL融合基因

P210型M-bcr（絕大多數(shù)）

b3-a2（55%）b2-a2（40%）b3-a2和b2-a2（5%）b3-a3（罕見）b2-a3（罕見）p230型u-bcr

e19-a2（罕見）白血病分子診療技術(shù)專家講座第32頁定性檢測：RT-PCR定量檢測：QRT-PCR白血病分子診療技術(shù)專家講座第33頁定性檢測匯報模板白血病分子診療技術(shù)專家講座第34頁定量檢測匯報白血病分子診療技術(shù)專家講座第35頁BCR-ABL融合基因ABL激酶突變檢測ABL激酶突變會引發(fā)伊馬替尼治療耐藥

T315I

耐藥機制:T315突變后不能與伊馬替尼形成關(guān)鍵性氫鍵，可完全阻斷伊馬替尼與ABL激酶區(qū)結(jié)合,從而耐藥。

P環(huán)突變(244-255)

耐藥機制：如Y253F／H、E255K／V、Q252H、G250E等經(jīng)過改變ABL激酶空間構(gòu)象，亦可妨礙伊馬替尼與之結(jié)合。白血病分子診療技術(shù)專家講座第36頁

A環(huán)突變(381-402)普通提升用藥量能夠降低耐藥程度。

其它突變對于耐藥程度較弱突變，如M244V、G250E、F317L、E355G、F359V及V379I等，經(jīng)過提升藥品劑量，能夠克服耐藥。白血病分子診療技術(shù)專家講座第37頁匯報模板白血病分子診療技術(shù)專家講座第38頁ALL病例中應(yīng)用t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLALL相關(guān)基因全套檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第39頁t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1融合基因t(1;19)(q23;p13)易位能夠在5-6%兒童ALL病例和3%成人ALL病例檢測到。這一易位幾乎全部出現(xiàn)在前B細胞ALL病例中。攜帶有該易位病人，其臨床癥狀都比較兇險。白血病分子診療技術(shù)專家講座第40頁t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因在50-70%嬰幼兒ALL和快要5%小兒和成人ALL病例中有MLL-AF4融合基因。t(4;11)(q21;q23)與前B-ALL相關(guān)。在嬰幼兒ALL中MLL-AF4融合基因被認為是預(yù)后不好標志。在成人ALL中也是一個壞標志，但對于成人ALL，該融合基因存在似乎能增強高劑量阿糖胞苷（Ara-c）療效。白血病分子診療技術(shù)專家講座第41頁t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1融合基因t(12;21)(p13;q22)是兒童ALL中最為常見易位，幾乎25%小兒ALL有該易位。其主要陽性病人出現(xiàn)在1-12歲之間，其中2-5歲這個年紀段最多。全部病例其免疫分型都是前B細胞ALL。t(12;21)陽性病人都有很好預(yù)后，其復(fù)發(fā)時間也會較晚。白血病分子診療技術(shù)專家講座第42頁t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL融合基因Ph染色體在5%小兒ALL和20-50%（隨年紀增加百分比也增加）成人ALL中也可見。在Ph+ALL中40%BCR-ABL融合基因是p210型，60%是p190型。在ALL中，PH陽性和隨之出現(xiàn)BCR-ABL融合基因是一個非常不好標志。白血病分子診療技術(shù)專家講座第43頁ALL相關(guān)基因全套檢測MLL/AFXMLL/AF1PMLL/AF4MLL/AF6dupMLLMLL/ENLE2A/PBX1BCR/ABL（p210）E2A/HLFBCR/ABL（p190）SIL/TAL1TEL/AML1TLS/ERGTEL/ABLHOX11白血病分子診療技術(shù)專家講座第44頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第45頁CLL病例中應(yīng)用IgVH基因重排檢測：

IgVH突變狀態(tài)：按照細胞IgVH突變狀態(tài)能夠?qū)LL分為突變CLL（M-CLL）與未突變CLL(U-CLL)。前者預(yù)后很好。而后者則疾病進展快，生存期短。白血病分子診療技術(shù)專家講座第46頁IgVH基因重排陽性CLL患者預(yù)后很好白血病分子診療技術(shù)專家講座第47頁融合基因套系臨床意義白血病31種融合基因篩查ALL、AML、CML、MDS等輔助診療、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測AML16種融合基因篩查AML輔助診療、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測ALL15種融合基因篩查ALL輔助診療、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測融合基因套系白血病分子診療技術(shù)專家講座第48頁白血病31種融合基因篩查

白血病分子診療技術(shù)專家講座第49頁其它檢測項目TCR/IgH重排BCL-1/JH、BCL-2/JH檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第50頁IGH與TCR重排淋巴細胞克隆性檢測對判別良、惡性淋巴細胞增生有主要參考價值。單克盛大排：淋巴細胞異常標志多克隆性重排：淋巴細胞正常生長發(fā)育IgH基因TCR基因T細胞B細胞重排成熟B細胞成熟T細胞白血病分子診療技術(shù)專家講座第51頁ALL、CLL、淋巴瘤輔助診療CLL預(yù)后判斷白血病分子診療技術(shù)專家講座第52頁ALL、CLL、淋巴瘤輔助診療白血病分子診療技術(shù)專家講座第53頁BCL-1/JH檢測BCL-1/JH[t(11;14)(q13;q32)]基因重排主要發(fā)生在套細胞淋巴瘤（MCL）當中,在60-70%MCL病例中有該易位存在，檢測BCL-1/JH基因重排可幫助判別診療套細胞淋巴瘤。白血病分子診療技術(shù)專家講座第54頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第55頁BCL-2/JHt(14;18)易位是B細胞淋巴瘤特有性變異，90%濾泡性淋巴瘤和20-30%彌漫性大B細胞淋巴瘤含有此易位。BCL-2/JH檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第56頁白血病分子診療技術(shù)專家講座第57頁標本要求骨髓2-3ml或外周血3-5mL（復(fù)發(fā)和微小殘留檢測：骨髓2-3ml）EDTA抗凝（紫頭管），4℃，24h內(nèi)送檢。白血病分子診療技術(shù)專家講座第58頁

細胞遺傳學

——染色體核型分析FISH白血病分子診療技術(shù)專家講座第59頁染色體核型分析適應(yīng)癥1.造血系統(tǒng)疾病初診2.末次化療結(jié)束兩周以上意義

對惡性血液病診療，分類分型，治療方案選擇，療效評定和預(yù)后預(yù)測方面都有主要價值。46，XY白血病分子診療技術(shù)專家講座第60頁t(9;22)(q34;q11),約占95%CML

Ph染色體

染色體核型分析——診療白血病分子診療技術(shù)專家講座第61頁8三體 ——單獨或附加異常，較多見于M1，M4，

M5，預(yù)后差或中等46,XY,+8白血病分子診療技術(shù)專家講座第62頁

FISH檢測熒光標識DNA探針原位雜交熒光顯微鏡檢測白血病分子診療技術(shù)專家講座第63頁FISH相對于染色體檢測，靈敏度高，特異性高。能夠填補染色體不足，染色體檢測為陰性，F(xiàn)ISH可能為陽性。

患者用藥后，染色體陽性率較低，F(xiàn)ISH可提升檢出率。

染色體核型與FISH白血病分子診療技術(shù)專家講座第64頁變異型Ｐh（復(fù)雜遮蔽型）易位FISH探針：BCR/ABL

檢測結(jié)果nucish9q34(ABL×2),22q34(BCR×2)(ABLconBCR×1)[200/400]白血病分子診療技術(shù)專家講座第65頁正常FISH組合結(jié)果，中位生存期約為111個月。FISH探針套系：CLL各探針中位生存期（月）p53基因缺失32ATM缺失7912號三體11413q14133RB1缺失133白血病分子診療技術(shù)專家講座第66頁FISH探針套系：MM各探針中位生存期（月）P53缺失24.7