菌落總數(shù)測定第1頁/共36頁食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗

菌落總數(shù)測定第2頁/共36頁菌落總數(shù)測定菌落的概念：菌落（colony）是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖而形成的能被肉眼所識別的生長物集落，它是由數(shù)以萬計的相同細(xì)菌集聚而成的。菌落總數(shù)的定義：樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質(zhì)等)，所得1mL(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果包括一群在方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧和兼性厭氧菌。第3頁/共36頁衛(wèi)生學(xué)意義：菌落總數(shù)主要作為判定樣品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察樣品中細(xì)菌的性質(zhì)和繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)綜合評價時提供科學(xué)依據(jù)。第4頁/共36頁主要修訂內(nèi)容培養(yǎng)基由營養(yǎng)瓊脂改為平板計數(shù)瓊脂。菌落計數(shù)公式進行了修改。添加了關(guān)于蔓延菌落的描述。添加了PetrifilmTM

細(xì)菌總數(shù)檢驗測試片法。添加了拍打式均質(zhì)器或等效的設(shè)備。第5頁/共36頁第一法平板計數(shù)法第6頁/共36頁培養(yǎng)基改變情況平板計數(shù)瓊脂（PCA)胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL營養(yǎng)瓊脂（NA)蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL第7頁/共36頁樣品處理添加了拍打式均質(zhì)器

或等效的設(shè)備關(guān)于均質(zhì)器使用效果和對檢測結(jié)果的影響，有不同的報道：不同食品樣品采用不同的均質(zhì)方法，測試結(jié)果不同。不同的均質(zhì)方式對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢測的影響也不同。第8頁/共36頁

菌落總數(shù)的檢驗程序圖檢樣10倍系列稀釋選擇2~3個適宜樣品勻液，各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量培養(yǎng)基(PCA)菌落計數(shù)36±１℃48±2h報告第9頁/共36頁樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。第10頁/共36頁用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。按上述操作制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。第11頁/共36頁根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1mL稀釋液加入2個無菌平皿作空白對照。及時將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL）。第12頁/共36頁培養(yǎng)瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。第13頁/共36頁菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，cfu）表示。選取菌落數(shù)在30cfu～300cfu之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30cfu的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300cfu的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。第14頁/共36頁其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長時(菌落之間無明顯界線)，則應(yīng)將每條鏈（不同來源）作為一個菌落計。第15頁/共36頁結(jié)果的表述-菌落總數(shù)的計算方法若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值再將平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每g(ml)中的菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按下列公式計算：

N=∑C/[n1+(0.1×n2)]×(d)第16頁/共36頁若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。第17頁/共36頁若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30~300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。第18頁/共36頁菌落總數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約。大于或等于100時，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可以用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約采用兩位有效數(shù)字。若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。稱重取樣以cfu/g為單位報告，體積取樣以cfu/mL為單位報告。第19頁/共36頁菌落總數(shù)計算公式的改變統(tǒng)計學(xué)依據(jù)：平板菌落數(shù)越多，結(jié)果越具有代表性；（不考慮稀釋倍數(shù)和培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況等）取樣量越大，結(jié)果越具有代表性；（同等取樣條件、排除其他方面的干擾因素）第20頁/共36頁計算公式公式使用的前提：有兩個連續(xù)稀釋度在適宜計數(shù)范圍內(nèi)（30～300個菌落數(shù)）N=∑C/[n1+(0.1×n2)]×(d)N：樣品中菌落數(shù)∑C：平板菌落數(shù)之和n1：適宜范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低）平板個數(shù)n2：適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高）平板個數(shù)d：第一稀釋度（低）第21頁/共36頁計算范例稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35第22頁/共36頁檢樣稀釋：檢樣稀釋時，應(yīng)以無菌操作稱取或量取有代表性在樣品25g（25mL）置225mL滅菌稀釋液中。固體樣品應(yīng)剪碎，以拍打式樣品處理器做成樣品懸液（1：10）。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和對樣品污染情況的估計，再進行10倍遞增稀釋。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支吸管，以保證樣品稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)確性。從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時，注意不要將管尖碰到手或其他沾污物可能觸及的部位。（如玻璃瓶口、試管品、仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分）。第23頁/共36頁進行稀釋時應(yīng)注意取樣的準(zhǔn)確性。（如：吸入液體時應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將液體放至所需刻度。放液體時，不要讓吸管接觸稀釋液的液面，可沿管壁放入，避免吸管外粘附的食品殘渣進入稀釋液體中）。第24頁/共36頁平板接種與培養(yǎng)：根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求和對樣品污染情況的估計，選擇2~3個稀釋度。加入樣品時要注意外來的污染。培養(yǎng)基傾注的溫度與厚度是實驗正確與否的關(guān)鍵。（傾注的溫度：一般35~45℃，溫度過高會造成已受損傷的菌細(xì)胞死亡。厚度：直徑9cm的平皿一般要求15~20mL培養(yǎng)基，若培養(yǎng)基太薄，在培養(yǎng)過程中可能因水分蒸發(fā)而影響細(xì)菌的生長）。第25頁/共36頁為防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在加入樣液后，應(yīng)在20min內(nèi)傾注培養(yǎng)基。檢樣與培養(yǎng)基混勻時，可先向一個方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反方向旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)防止混合物濺到皿邊的上方。培養(yǎng)基凝固后，應(yīng)在盡快將平皿翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，保持瓊脂表面干燥，盡量避免菌落蔓延生長，影響計數(shù)。為控制污染，在實驗過程中，應(yīng)在工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露時間應(yīng)與檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長時間相當(dāng)，然后與檢樣一同培養(yǎng)，以了解檢樣在操作過程中有無受到來自外界的污染。第26頁/共36頁培養(yǎng)溫度:

每種不同樣品中的細(xì)菌都有一定的生理特性，培養(yǎng)時應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及生理條件可能得出不同的結(jié)果，因而應(yīng)根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。食品：36±１℃，48±2h。飲用水：36±１℃，48h。水產(chǎn)品：30±１℃，72±3h。(36℃培養(yǎng)和30℃培養(yǎng)結(jié)果差別較大，同樣水產(chǎn)品48h結(jié)果和72h也有差別。)第27頁/共36頁對照試驗：檢樣的稀釋液中往往帶有食品顆粒，在這種情況下，為避免與細(xì)菌菌落混淆，可作一檢樣對照，不經(jīng)培養(yǎng)，置4℃環(huán)境放置，在計數(shù)時用于對照?；蚩蛇x用TTC營養(yǎng)瓊脂作培養(yǎng)基。第28頁/共36頁菌落計數(shù)：如果高稀釋度平板上的菌落數(shù)比低稀釋度平板上的菌落數(shù)高，則說明檢驗過程中可能出現(xiàn)差錯或樣品中含抑菌物質(zhì)，這樣的結(jié)果不可用于結(jié)果報告。如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落間沒有明顯的界限，這可能是瓊脂與檢樣混勻時，一個細(xì)菌塊被分散所造成的。一條鏈作為一個菌落計。若培養(yǎng)過程中遭遇昆蟲侵入，在昆蟲爬行過的地方也會出現(xiàn)鏈狀菌落，也不應(yīng)分開計數(shù)。第29頁/共36頁如果平板上菌落太多，不能計數(shù)時，不能用多不可計作報告。應(yīng)在最高稀釋度平板上任意選取2個1cm2的面積，計算菌落數(shù)，除2求出每cm2面積內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以63.6(皿底面積cm2數(shù))。如果檢樣是微生物類制劑（酸牛奶、酵母制酸性飲料等），在進行菌落計數(shù)時應(yīng)將有關(guān)微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告。在進行菌落計數(shù)時，檢樣中的霉菌和酵母菌也不應(yīng)計數(shù)。第30頁/共36頁第二法PetrifilmTM

細(xì)菌總數(shù)試片法第31頁/共36頁PetrifilmTM

細(xì)菌總數(shù)試片法原理：細(xì)菌具有脫氫酶能使相應(yīng)的底物脫氫而釋放出氫離子，培養(yǎng)基中的TTC作為氫離子的受體，在接受氫離子后被還原為紅色非溶解性產(chǎn)物-三苯甲，從而使細(xì)菌著色，達到易觀察、便計數(shù)的效果。優(yōu)點：培養(yǎng)基具有良好的生產(chǎn)質(zhì)量；菌落計數(shù)特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現(xiàn)象；第32頁/共36頁方格設(shè)計，便于計數(shù)；菌落分布特別均勻；平行平板菌落結(jié)果一致性比較好，這與避免了培養(yǎng)基對細(xì)菌熱損傷有關(guān)；菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生；安全方面：不像玻璃平皿易碎、對人員造成潛在的傷害，另外密封比較好，不容易直接接觸。第33頁/共36頁缺點：某些有紅色顆粒的，需要注意；粘稠的液體樣品，不易分散開；表面活性比較大，易流出；泡沫比較豐富的樣品等顏色特別重的，如桔黃色，掩蓋了菌落；抑菌劑濃度比較高時；辣根及辣根粉