菌種保藏的學(xué)習(xí)材料第1頁(yè)/共25頁(yè)概念標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。第2頁(yè)/共24頁(yè)第2頁(yè)/共25頁(yè)中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株

第3頁(yè)/共24頁(yè)第3頁(yè)/共25頁(yè)法國(guó)生物梅里埃公司提供的商業(yè)派生菌株第4頁(yè)/共24頁(yè)第4頁(yè)/共25頁(yè)保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株第5頁(yè)/共24頁(yè)第5頁(yè)/共25頁(yè)制備的工作菌株第6頁(yè)/共24頁(yè)第6頁(yè)/共25頁(yè)菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)始時(shí)，在群體細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負(fù)變），不會(huì)使群體菌株性能發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代，群體中的負(fù)變個(gè)體達(dá)到一定數(shù)量，發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)群體，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)為嚴(yán)重的衰退。第7頁(yè)/共24頁(yè)第7頁(yè)/共25頁(yè)菌種衰退的原因1、菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。2、表型延遲現(xiàn)象也會(huì)造成菌種衰退。3、質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)?？刂频?。4、連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。5、不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。第8頁(yè)/共24頁(yè)第8頁(yè)/共25頁(yè)如何預(yù)防衰退1、合理的育種2、選用合適的培養(yǎng)基3、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件4、控制傳代次數(shù)5、利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代6、采用有效的菌種保藏方法第9頁(yè)/共24頁(yè)第9頁(yè)/共25頁(yè)菌種的復(fù)壯菌種的復(fù)壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。第10頁(yè)/共24頁(yè)第10頁(yè)/共25頁(yè)復(fù)壯的方法1、純種分離。采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來(lái)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進(jìn)行性能測(cè)定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來(lái)，經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。2、通過(guò)寄主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）。主要是對(duì)一些寄生性的菌株，可以將衰退的菌株接種到相應(yīng)的宿主體內(nèi)，提高其寄生性能及其它性能。3、淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）。可以采用各種外界不良理化條件,使發(fā)生衰退的個(gè)體死亡,從而留下群體中生長(zhǎng)健壯的個(gè)體.4、4、采用有效的菌種保藏方法。第11頁(yè)/共24頁(yè)第11頁(yè)/共25頁(yè)菌種保藏的基本原理微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過(guò)程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的第12頁(yè)/共24頁(yè)第12頁(yè)/共25頁(yè)選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長(zhǎng)期地保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。（二）菌種保藏步驟①挑選特征典型的純菌菌落；②確定保藏的合適菌體形態(tài)；③選擇最適宜的保藏方法；④定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。第13頁(yè)/共24頁(yè)第13頁(yè)/共25頁(yè)1.瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔

2~3個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年~一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。

（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。第14頁(yè)/共24頁(yè)第14頁(yè)/共25頁(yè)大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面第15頁(yè)/共24頁(yè)第15頁(yè)/共25頁(yè)各類菌種保藏條件及時(shí)間

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時(shí)間細(xì)菌一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）第16頁(yè)/共24頁(yè)第16頁(yè)/共25頁(yè)（3）特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)是——簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。

缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。第17頁(yè)/共24頁(yè)第17頁(yè)/共25頁(yè)（4）注意事項(xiàng)：保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。

必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。

每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。

保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，其他菌類含糖小于2%為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影響菌種存活。

銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

第18頁(yè)/共24頁(yè)第18頁(yè)/共25頁(yè)

2、液體石蠟保存法：

本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。

（1）方法：

將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5%瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。第19頁(yè)/共24頁(yè)第19頁(yè)/共25頁(yè)

將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。

第20頁(yè)/共24頁(yè)第20頁(yè)/共25頁(yè)

液體石蠟對(duì)各類菌種保藏效果

菌種菌株數(shù)保存時(shí)間（年）存活率（%）細(xì)菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3第21頁(yè)/共24頁(yè)第21頁(yè)/共25頁(yè)（3）特點(diǎn)：

本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，

該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）注意事項(xiàng)：

①保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征

后，方可進(jìn)行保藏。②保藏過(guò)程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種。③使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。第22頁(yè)/共24頁(yè)第22頁(yè)/共25頁(yè)④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。⑤液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控