單克隆抗體制備演示文稿目前一頁\總數(shù)四十四頁\編于五點單克隆抗體制備目前二頁\總數(shù)四十四頁\編于五點本章內(nèi)容單克隆抗體概念、特性、與多克隆抗體的異同點？雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤細胞的克隆方法單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用目前三頁\總數(shù)四十四頁\編于五點概念多克隆抗體（PcAb）：針對抗原不同表位的多個B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的混合抗體單克隆抗體（McAb）：只針對抗原單一表位的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體目前四頁\總數(shù)四十四頁\編于五點為何要使用單克隆抗體？一個抗原分子可能含有許多抗原表位一個B細胞只會生產(chǎn)一種抗體傳統(tǒng)抗血清對相似抗原會有交叉反應(yīng)性目前五頁\總數(shù)四十四頁\編于五點一個抗原分子上常有許多表位抗原分子上可以誘導(dǎo)出抗體的部位或片段，稱為eptope、antigenicdeterminant；一個抗原分子上通常都有許多eptope

，每個eptope至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統(tǒng)抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別針對這些不同的eptope。目前六頁\總數(shù)四十四頁\編于五點一個B細胞只會生產(chǎn)一種抗體

血清中的每一種抗體是由單一種B細胞

所分泌產(chǎn)生，若能把此B細胞由脾臟中挑出來，單獨培養(yǎng)成細胞株，則可獲得單一種類的抗體，只會對一種eptope反應(yīng)。大量培養(yǎng)此細胞株，即可有品質(zhì)一定、純度均一的抗體，即單克隆抗體。目前七頁\總數(shù)四十四頁\編于五點抗血清對相似抗原會有交叉反應(yīng)性對于分子構(gòu)造相似的抗原，由于它們含有共同或相似的eptope

，所產(chǎn)生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產(chǎn)生反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)性。同時又由于免疫動物的個體差異，對抗原的反應(yīng)也有相當?shù)牟町?，以致無法準確控制所得到每批抗血清效價的高低目前八頁\總數(shù)四十四頁\編于五點抗血清和單克隆抗體制備

目前九頁\總數(shù)四十四頁\編于五點B細胞無法在培養(yǎng)基中生長

B細胞不易在培養(yǎng)基中生長，雖然有人一直努力，想找出在體外培養(yǎng)脾臟細胞的條件，但結(jié)果均不甚理想。(見圖中央的4號B細胞，X表示無法培養(yǎng))目前十頁\總數(shù)四十四頁\編于五點腫瘤細胞可在培養(yǎng)基中永久生長

腫瘤細胞可在培養(yǎng)基中永久生長：若把瘤細胞永久生長的特性，利用細胞融合技術(shù)導(dǎo)入可生產(chǎn)抗體的B細胞中，則得到可在培養(yǎng)基中永久生長的B細胞株，即雜交瘤細胞株。

目前十一頁\總數(shù)四十四頁\編于五點

1975年Koehler和Milstein在Nature雜志聯(lián)名發(fā)表題為“分泌預(yù)定特異性抗體的融合細胞持續(xù)培養(yǎng)“的論文，宣告單克隆抗體的誕生，該成果獲1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎和生理獎.

目前十二頁\總數(shù)四十四頁\編于五點雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體目前十三頁\總數(shù)四十四頁\編于五點雜交瘤技術(shù)的基本原理

雜交瘤技術(shù)是將能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進行無限繁殖的B淋巴細胞與能在體外進行無限繁殖，但不能產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性：既能夠分泌特異性的抗體，又能夠在體外長期繁殖。雜交瘤細胞經(jīng)過篩選、克隆化培養(yǎng)后成為單個細胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。

目前十四頁\總數(shù)四十四頁\編于五點單克隆抗體制備流程圖目前十五頁\總數(shù)四十四頁\編于五點親本細胞的選擇與制備細胞株穩(wěn)定，易傳代培養(yǎng)；細胞株本身不產(chǎn)生Ig是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)換酶缺陷株(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT)最常用的骨髓瘤細胞是NS-1和SP2/0細胞株骨髓瘤細胞

(NS-1)骨髓瘤細胞需定期用8-氮鳥嘌呤(8-AG)處理目前十六頁\總數(shù)四十四頁\編于五點親本細胞的選擇與制備免疫脾細胞：是經(jīng)過抗原誘導(dǎo)活化的免疫細胞，具有分泌抗體的能力

8-12周齡BALB/c小鼠先以目標抗原(如菌體)免疫，抗原需加佐劑(adjuvant）注入小鼠體內(nèi)慢慢釋出，誘使B細胞成熟增殖并生產(chǎn)抗體。試采血確定有抗體產(chǎn)生后，即可取出

脾臟以收集脾臟細胞(大多為B細胞)與骨髓瘤細胞進行細胞融合。

注意乳劑的生產(chǎn)要完全，可取小量滴入水中，震動后應(yīng)該不會散去。

有人打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。但除非抗原來源困難或有其它目的，我們?nèi)圆捎脗鹘y(tǒng)方法，因免疫反應(yīng)的啟動機制非常復(fù)雜，生物整體的免疫反應(yīng)是最可靠的。

目前十七頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前十八頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前十九頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前二十頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前二十一頁\總數(shù)四十四頁\編于五點細胞融合小鼠脾細胞B

與NS-1細胞

N

以PEG

進行融合，操作在2min內(nèi)完成。PEG可導(dǎo)致細胞膜上脂類物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜容易打開而有助于細胞融合。目前二十二頁\總數(shù)四十四頁\編于五點

目前二十三頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前二十四頁\總數(shù)四十四頁\編于五點常見的幾種融合形式目前二十五頁\總數(shù)四十四頁\編于五點細胞DNA合成途經(jīng)目前二十六頁\總數(shù)四十四頁\編于五點HAT選擇培養(yǎng)基三種關(guān)鍵成分：

次黃嘌呤（hypoxanthine,H）

氨基蝶呤（aminopterin,A）

胸腺嘧啶（thymidine，T）◆是根據(jù)細胞內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途徑設(shè)計的用于篩選雜交瘤細胞的特殊培養(yǎng)基。

目前二十七頁\總數(shù)四十四頁\編于五點

葉酸參與DNA合成過程，而氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，能阻斷該合成途徑?！鬑AT培養(yǎng)基中含有葉酸拮抗劑-氨基蝶呤，故所有細胞DNA合成的主要途徑均被阻斷，只能通過替代途徑合成?！綦s交瘤細胞從脾細胞中獲得HGPRT，同時又繼承了骨髓瘤細胞長期生長繁殖的特性，能夠在HAT培養(yǎng)基中得以生存而被篩選出來。目前二十八頁\總數(shù)四十四頁\編于五點核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸氨基碟呤（A）HAT核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）DNA目前二十九頁\總數(shù)四十四頁\編于五點篩選方法初步篩選：融合后馬上以HAT培養(yǎng)，能活下來的都是B細胞與NS-1的正確融合細胞，但此時細胞的遺傳背景尚未十分穩(wěn)定。

篩選特異性抗體：

并非所有B細胞都會產(chǎn)生我們所要的抗體，小鼠原先就存在許多B細胞株對抗一般疾??；因此要用酶聯(lián)免疫分析法

（ELISA）挑出特異性抗體目前三十頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前三十一頁\總數(shù)四十四頁\編于五點陽性雜交瘤細胞的克隆化克隆化

從抗體陽性孔中分離出單個細胞進行培養(yǎng)，使之繁殖成單一細胞集落的過程。有限稀釋法：最常用的方法顯微操作法熒光激活細胞分選法軟瓊脂平板法目前三十二頁\總數(shù)四十四頁\編于五點

有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔目前三十三頁\總數(shù)四十四頁\編于五點將陽性孔細胞株稀釋，重新平分到96孔細胞培養(yǎng)板中，以計算使得每孔中只含有一個細胞（例如每mL含有100個細胞，若只要取一個細胞放到一個培養(yǎng)孔中，那你應(yīng)該吸取多少mL？0.01mL），待其生長成群落后，再次以ELISA篩選特異性抗體。目前三十四頁\總數(shù)四十四頁\編于五點克隆化需至少進行3-5次目前三十五頁\總數(shù)四十四頁\編于五點陽性雜交瘤細胞的凍存目的：保證雜交瘤細胞不會因污染或過多傳代變異丟失染色體而喪失功能。凍存液：10%-90%小牛血清+10%二甲亞砜（DMSO），1X106-5X106/0.5mL逐步降溫:-800C過夜,再放入液氮目前三十六頁\總數(shù)四十四頁\編于五點單克隆抗體生產(chǎn)小鼠體內(nèi)誘生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑選出來的雜交瘤細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然后以針頭收集所產(chǎn)生的

腹水，通?？扇〉?5mL左右；腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達數(shù)mg。

2)體外增量培養(yǎng)法：把雜交瘤細胞在大型培養(yǎng)槽中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清即得抗體，但每mL只得約數(shù)mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養(yǎng)瓶，可產(chǎn)生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。目前三十七頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前三十八頁\總數(shù)四十四頁\編于五點目前三十九頁