動物基因工程大連大學生物工程學院04（1）班主講：孫賢標組員：王國豐、張萬杰、于麗麗、王鑫、孫賢標動物基因工程專家講座第1頁

動物基因工程是利用DNA重組技術(shù)對動物所進行工程操作。從遺傳學角度分為：遺傳性動物基因工程：外源基因能夠經(jīng)過配子進行垂直傳遞并穩(wěn)定遺傳。非遺傳性動物基因工程：轉(zhuǎn)基因僅在當代表現(xiàn)，不能夠遺傳給子代。動物基因工程專家講座第2頁第一節(jié)動物基因工程發(fā)展情況與趨勢動物基因工程實質(zhì)是改變動物遺傳組成，增加動物遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因動物新表型特征，使能夠更加好地服務(wù)與人類社會。動物基因工程專家講座第3頁動物基因工程專家講座第4頁世界首只轉(zhuǎn)基因靈長類動物

——-安迪世界第一只轉(zhuǎn)基因動物動物基因工程專家講座第5頁動物基因工程專家講座第6頁HBV轉(zhuǎn)基因動物樹鼩動物基因工程專家講座第7頁

從轉(zhuǎn)基因技術(shù)伎倆來看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導法、精子介導法、胚胎干細胞介導法和核移植法等各種轉(zhuǎn)基因方法。

轉(zhuǎn)基因細胞核移植技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)主流方法。1、從簡單顯微注射法向高效率轉(zhuǎn)基因體細胞核移植方向發(fā)展

動物基因工程專家講座第8頁

轉(zhuǎn)基因在基因組中存在方式有兩種，即隨機整合和定點整合。為了到達外源基因高效表示，在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)上增加了含有位點控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)等調(diào)控元件，能夠?qū)崿F(xiàn)插入位點非依賴性、拷貝數(shù)相關(guān)表示模式。LCR和MAR功效不受種屬差異限制，不論外源基因插入什么位點，都能夠維持一個開放染色體結(jié)構(gòu)，有利于基因表示?；虼虬屑夹g(shù)出現(xiàn)與發(fā)展，實現(xiàn)了對目標基因定位操作。2、從外源基因隨機插入（或整合）到定點整合轉(zhuǎn)變

動物基因工程專家講座第9頁

從轉(zhuǎn)基因策略來看，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了兩個階段：第一階段為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物階段，第二階段為條件性轉(zhuǎn)基因動物階段。借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將單一功效基因和基因簇引入高等動物基因組，或?qū)⒛繕嘶驈膭游锘蚪M中敲除，實現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間基因轉(zhuǎn)移或修飾，產(chǎn)生新基因型和表型。當前轉(zhuǎn)基因動物主要應(yīng)用在生物學基礎(chǔ)研究、醫(yī)學疾病模型、動物生物反應(yīng)器、異種器官移植、動物遺傳改良等５個方面。３、從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制轉(zhuǎn)變動物基因工程專家講座第10頁

第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)一、動物基因工程載體二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)動物基因工程專家講座第11頁一、動物基因工程載體作為動物基因工程載體必須具備以下幾個功效：

為外源基因提供進入受體細胞轉(zhuǎn)移能力為外源基因提供在受體細胞內(nèi)復制或整合能力為外源基因提供在受體細胞內(nèi)擴增和表示能力動物基因工程專家講座第12頁動物基因工程載體質(zhì)粒型表示載體病毒載體定向打靶載體動物基因工程專家講座第13頁1.質(zhì)粒型表示載體表示載體共同特點是都帶有原核復制區(qū)和選擇性標識基因，確保重組DNA分子能夠在大腸桿菌中擴增，同時也必須包含能在真核細胞表示相關(guān)組件。普通包含轉(zhuǎn)錄外源DNA序列開啟元件、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效地加上poly（A）尾巴所必需信號序列、真核細胞中選擇性標識，另外還增加了一些附加元件，如增強子、內(nèi)含子、剪接供體與受點，以確保外源基因高效表示。動物基因工程專家講座第14頁以山羊乳腺特征表示載體pBC1為例動物基因工程專家講座第15頁2.病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移病毒載體須具備以下基本條件：攜帶外源基因并能夠包裝成病毒顆粒介導外源基因轉(zhuǎn)移與表示對機體不致病動物基因工程專家講座第16頁（1）腺病毒（adenovirus）

腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體有許多特點：基因組重排率低外源基因與病毒DNA重組后能遺傳幾個周期安全性好，不會整合到人染色體上，不造成腫瘤發(fā)生宿主范圍廣，對受體細胞是否處于分裂期要求不高外源基因在載體上輕易高效表示動物基因工程專家講座第17頁（2）腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）腺相關(guān)病毒是一個天然復制缺點型非致病性單鏈DNA病毒，其復制需要有輔助病毒共轉(zhuǎn)染。無共轉(zhuǎn)染時，野生型AAV優(yōu)先（70%）整合在人染色體19q13.3位點處，潛伏存在直至被輔助病毒拯救出來。其整合需要基因組兩端ITR，以及非結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白Rep78和Rep68存在。

動物基因工程專家講座第18頁AAV含有以下幾個方面特點：非致病性、無免疫原性和無炎癥反應(yīng)能感染靜止期細胞，如神經(jīng)元細胞插入外源基因表示時間長，普通能夠到達1年之多宿主范圍廣熱穩(wěn)定性強，輕易經(jīng)過滅活輔助腺病毒純化動物基因工程專家講座第19頁（3）反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒是一個整合型單鏈RNA病毒，感染宿主細胞后，病毒顆粒中pol基因表示出反轉(zhuǎn)錄酶，以單鏈RNA基因組為模板，馬上轉(zhuǎn)錄出一份線形雙鏈DNA復本，然后在整合酶（Int）介導下，整合到宿主基因組內(nèi)，此時整和病毒序列被稱為前病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到宿主細胞基因組后，其DNA隨宿主DNA復制而復制，并由5`-LTR中一個強開啟子轉(zhuǎn)錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時又含有mRNA模板活性，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。在宿主細胞質(zhì)中，兩條相同RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝與內(nèi)殼中，形成成熟病毒顆粒以芽植方式分泌至細胞外，但通常不致死宿主細胞。動物基因工程專家講座第20頁3.定向打靶載體基因打靶是經(jīng)過外源基因與靶細胞染色體上同源序列間同源重組，將外源基因定點整合到靶細胞特定位置上，而使某一個特定位點上基因發(fā)生定點突變技術(shù)。在細胞內(nèi)存在兩條相同DNA鏈（同源染色體），在細胞內(nèi)酶作用下，能夠?qū)⑵淝虚_，發(fā)生交叉，然后重新連接，從而發(fā)生DNA鏈交換并引發(fā)重組。動物基因工程專家講座第21頁（1）基因敲除敲除型載體由兩段與基因組內(nèi)靶基因座序列同源DNA片段（又稱同源臂）組成，中間為正向選擇標識，同緣臂外側(cè)為真核細胞中負選擇標識及在原核細胞中進行復制與篩選載體DNA序列。動物基因工程專家講座第22頁（2）基因敲入基因敲入是利用同源重組原理將外源基因插入到染色體特定位點上?；蚯萌朕D(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)設(shè)計上相同于基因敲除結(jié)構(gòu)，但區(qū)分在于：

或用外源基因替換并失活靶基因或在不影響拔基因功效前提下插入新基因或在染色體上特定位點插入新外源基因，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，并使得外源基因高效表示動物基因工程專家講座第23頁（3）基因下調(diào)（knock-down）

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）又被稱為基因下調(diào)，經(jīng)過干擾RNA（smallinterferencesiRNA）分子作用到達轉(zhuǎn)錄后基因緘默效應(yīng)。

siRNA制備方法主要包含體外合成siRNA和siRNA表示載體兩種。體外合成siRNA易轉(zhuǎn)染細胞，進入細胞后，可直接發(fā)揮作用，普通不存在siRNA表示載體轉(zhuǎn)錄效率低及細胞毒性等問題。不過體外合成siRNA只能瞬間干擾，不能到達長久抑制病毒效果。

動物基因工程專家講座第24頁二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

物理轉(zhuǎn)染法

化學轉(zhuǎn)染法

生物法動物基因工程專家講座第25頁1.物理轉(zhuǎn)染法（1）電擊法（electroporation）其基本原理是在外加電場作用下，細胞膜電位發(fā)生改變，細胞質(zhì)膜瞬間出現(xiàn)可逆性電穿孔，從而使一定數(shù)量外源DNA從細胞外擴散到細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，并深入整合到宿主DNA上，到達轉(zhuǎn)基因目標。動物基因工程專家講座第26頁圖1.利用點穿孔法進行基因轉(zhuǎn)移動物基因工程專家講座第27頁（2）顯微注射法

是將外源DNA在顯微鏡操作系統(tǒng)輔助下，經(jīng)過玻璃微管直接將外源DNA注入哺乳動物受精卵原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，制備轉(zhuǎn)基因動物。動物基因工程專家講座第28頁（3）基因槍法

基本原理是將要轉(zhuǎn)染DNA吸附到高黏度金屬（鈣或金等）顆粒上，在一個加速裝置作用下，將這些粒子高速打入細胞或組織內(nèi)，到達轉(zhuǎn)基因目標動物基因工程專家講座第29頁（4）超聲波法（sonoporation）

超聲波增強基因轉(zhuǎn)染法主要機制是聲波空化效應(yīng)造成細胞通透性增高，而經(jīng)過添加超生造影劑能降低空化域值，增強空化效應(yīng)，促進外源基因進入細胞，提升基因轉(zhuǎn)染效果動物基因工程專家講座第30頁2.化學轉(zhuǎn)染法（1）磷酸鈣法

將待轉(zhuǎn)染DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2后，DNA片段與磷酸鈣共沉淀并形成大顆粒；將此顆粒懸浮液加入貼壁培養(yǎng)細胞中，外源DNA就被靶細胞所吸收，進而實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。 動物基因工程專家講座第31頁圖2.利用磷酸鈣共沉淀法進行DNA轉(zhuǎn)染動物基因工程專家講座第32頁圖3.質(zhì)脂體介導基因轉(zhuǎn)移（2）脂質(zhì)體法（lipofection）將待轉(zhuǎn)染DNA溶液與磷脂混合，后者在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。當這種脂質(zhì)體懸液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進入細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)。動物基因工程專家講座第33頁（3）原生質(zhì)體融正當

含有目標基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌或酵母細胞。大量擴增，利用溶菌酶或蝸牛酶去除胞壁部分，在高鹽條件下制成原生質(zhì)體，然后散鋪在單層培養(yǎng)哺乳動物細胞上，在融和劑（如聚乙二醇）作用下，使染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)如細胞內(nèi)，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物基因工程專家講座第34頁

構(gòu)建含有選擇性標識反轉(zhuǎn)錄病毒基因組部分DNA與質(zhì)粒雜合型載體分子，在多克隆位點插入外源基因形成重組DNA分子，克隆到大腸桿菌中擴增判定；重組DBA分子經(jīng)過物理或化學方法轉(zhuǎn)入一個特制病毒包裝細胞系。轉(zhuǎn)染入包裝細胞系重組DNA轉(zhuǎn)錄出對應(yīng)重組RNA分子，包裝細胞系分泌出來重組反轉(zhuǎn)錄病毒，便可感染其它類型動物受體細胞，重組RNA分子以DNA形式整合到染色體上，并表示外源基因。3.病毒感染法

動物基因工程專家講座第35頁

圖4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體穩(wěn)定、長久表示外源基因

原病毒DNA轉(zhuǎn)染進包裝細胞中，包裝原病毒產(chǎn)生將病毒RNA包裝成感染性病毒粒子全部蛋白質(zhì)，但卻不能包裝本身RNA動物基因工程專家講座第36頁第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物制備轉(zhuǎn)基因動物制備程序轉(zhuǎn)基因判定表示水平檢測轉(zhuǎn)基因動物傳代與檢測動物基因工程專家講座第37頁一轉(zhuǎn)基因動物制備程序DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因體細胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛動物基因工程專家講座第38頁1、DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠超數(shù)排卵

基因制備

胚胎移植顯微注射

轉(zhuǎn)基因個體判定

動物基因工程專家講座第39頁動物基因工程專家講座第40頁顯微注射技術(shù)動物基因工程專家講座第41頁2、胚胎干細胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠

胚胎干細胞是從早期胚胎內(nèi)細胞團中分離出未分化、含有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性細胞。優(yōu)點：

能夠在體外進行人工培養(yǎng)、長久擴增、冷凍保留動物基因工程專家講座第42頁胚胎干細胞制備轉(zhuǎn)基因動物過程（1）轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞取得（2）囊胚注射（3）嵌合體檢測和育種

轉(zhuǎn)基因嵌合個體制備目標是為了取得轉(zhuǎn)基因后代動物基因工程專家講座第43頁胚胎干細胞基因轉(zhuǎn)化法(引自G1ick&Pasternak，1998)動物基因工程專家講座第44頁判斷是否是種系嵌合

首先用轉(zhuǎn)基因嵌合體小鼠與正常小鼠交配，對其后代進行檢測，假如后代中有轉(zhuǎn)基因個體出現(xiàn)，證實為種系嵌合，然后將轉(zhuǎn)基因雜合子個體進行橫交就會取得轉(zhuǎn)基因純合子和雜合子個體。假如在后代中沒能發(fā)覺轉(zhuǎn)基因純合子，應(yīng)注意是否因為轉(zhuǎn)基因純合造成了胚胎早期死亡，無法得到成活個體所致。動物基因工程專家講座第45頁基因準備供體細胞獲取傳代培養(yǎng)、擴增供體細胞轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因供體細胞篩選與擴增卵母細胞取得體外成熟培養(yǎng)卵母細胞去核核移植重構(gòu)胚體外培養(yǎng)胚胎移植取得轉(zhuǎn)基因個體3、轉(zhuǎn)基因體細胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛動物基因工程專家講座第46頁二轉(zhuǎn)基因判定標識篩選法（1）正負選擇標識篩選法（2）無開啟子篩選法利用靶基因上開啟子來轉(zhuǎn)錄標識基因mRNA并翻譯出特定蛋白質(zhì)，而到達篩選目標。分子判定法（1）PCR擴增（2）斑點雜交（3）Southern雜交（4）熒光原位雜交動物基因工程專家講座第47頁三表示水平檢測取得高效表示、含有較強生物學活性目標是蛋白是轉(zhuǎn)基因主要目標之一。得到目標蛋白形式：

表示于細胞內(nèi)，可經(jīng)過對組織或細胞裂解獲取；分泌到細胞外，可經(jīng)過酶學或免疫學方法進行測定。動物基因工程專家講座第48頁1、匯報基因

匯報基因是編碼輕易檢測蛋白質(zhì)核苷酸序列，普通用以替換難于測定蛋白質(zhì)基因，或制備融合蛋白，或利用IRES與目標蛋白形成一條mRNA序列，分別翻譯出兩種蛋白，來研究目標蛋白功效及其表示特征。動物基因工程專家講座第49頁2、Northern雜交能夠檢測轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)染細胞是否轉(zhuǎn)錄出目標基因所對應(yīng)mRNA3、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是將由mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA第一鏈為模板進行目標基因或片斷擴增PCR反應(yīng)。利用RT-PCR方法擴增出目標基因電泳條帶，以檢測目標基因是否表示。動物基因工程專家講座第50頁4、聚丙烯酰胺凝膠電泳分析靶組織或轉(zhuǎn)基因細胞總蛋白，依據(jù)相對分子質(zhì)量標準判定是否有目標蛋白條帶出現(xiàn)，進而判定外源基因表示情況，同時能夠初步判定目標蛋白表示水平。5、Western雜交

可用來檢測混合蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標蛋白，最小檢出量為1ng。6、目標蛋白生物活性

應(yīng)選擇對應(yīng)生物學測定方法進行測定。當產(chǎn)品生物學活性較天然蛋白活性低時，應(yīng)該對蛋白質(zhì)結(jié)合功效分子集團進行研究。動物基因工程專家講座第51頁四轉(zhuǎn)基因動物傳代與檢測判斷是否生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動物主要標準是檢驗外源基因是否整合到動物生殖系統(tǒng)中，即是否能夠穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)基因動物傳代慣用常規(guī)繁殖方法進行，如有必要，也可采取特殊方法。普通用轉(zhuǎn)基因檢測陽性動物與已知非轉(zhuǎn)基因動物交配，這么做能夠很好度量被整合外源基因傳遞規(guī)律。

動物基因工程專家講座第52頁第四節(jié)轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用與未來一、轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用二、轉(zhuǎn)基因動物生物安全性三.動物轉(zhuǎn)基因未來動物基因工程專家講座第53頁一、轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用

提升動物生產(chǎn)性能（1）改良畜禽生產(chǎn)性狀

在轉(zhuǎn)基因“碩鼠”啟發(fā)下，人們試圖經(jīng)過外源基因?qū)胩嵘笄莓a(chǎn)品產(chǎn)量，加緊生長速度，降低飼料消耗和改良產(chǎn)品品質(zhì)。（2）提升畜禽抗病力