一、微生物接種技術一）、試驗目標

學習微生物接種工具使用，掌握無菌操作方法，建立有菌概念。二）、試驗原理無菌技術：指在微生物試驗工作中，控制或預防各類微生物污染及其干擾一系列操作方法和相關辦法。接種：將微生物接到適于它生長繁殖人工培養(yǎng)基上或活生物體內過程。實驗五無菌操作及接種技術專家講座第1頁三）試驗用具

實驗五無菌操作及接種技術專家講座第2頁四）試驗步驟：1、接種工具介紹接種環(huán)、接種鉤、接種針、接種圈、接種鋤、玻璃涂棒、其它接種工具實驗五無菌操作及接種技術專家講座第3頁2、超凈工作臺超凈工作臺是為試驗室工作提供無菌操作環(huán)境設施，以保護試驗免受外部環(huán)境影響，同時為外部環(huán)境提供一些程度保護以防污染并保護操作者。原理：超凈工作臺潔凈環(huán)境是在特定空間內，潔凈空氣(進濾空氣)按設定方向流動而形成。以氣流方向來分，現(xiàn)有超凈工作臺可分為垂直式，由內向外式以及側向式。實驗五無菌操作及接種技術專家講座第4頁垂直流超凈工作臺水平流超凈工作臺垂直流超凈工作臺實驗五無菌操作及接種技術專家講座第5頁超凈臺使用與維護風速保持在0.32-0.48米/秒使用前打開紫外燈照射40~60min開啟超凈工作臺工作電源，關閉紫外燈，并用75%酒精或0.5%過氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺面。使用中，有機玻璃罩受到污染，禁止用酒精棉球擦拭，請用含水棉布檫拭；請保持超凈臺整齊、干燥，不要堆積雜物；使用完成，關閉煤氣開關或酒精燈；使用完成后，用消毒液擦拭工作臺面，關閉工作電源，重新開啟紫外燈照射15min.定時做無菌試驗，以測定凈化臺是否符合無菌要求。實驗五無菌操作及接種技術專家講座第6頁2、無菌操作關鍵點1）、要求建立“有菌概念”。2）、接種時要有一個潔凈環(huán)境，整個操作過程必須在火焰旁進行。3）接種環(huán)，棉塞一定要拿在手上，不能隨便亂丟。3、微生物接種技術1）、斜面接種技術從斜面菌種將菌移接至另一斜面培養(yǎng)基方法，叫做斜面接種。實驗五無菌操作及接種技術專家講座第7頁接種方法：A、接種前用酒精棉球擦凈桌面；B、將試管貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等，然后用酒精棉球擦手消毒；C、點燃酒精燈以后，在火焰旁將每一支試管內棉塞稍微轉一下，使其松動，方便在接種時易拔出，并將試管放在試管架上，放在接種臺右前方；實驗五無菌操作及接種技術專家講座第8頁D、將菌種和斜面培養(yǎng)基兩支試管，用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部分，斜向上，并使他們呈水平位置，也可將試管橫放在左手掌中央，用四個手指托住試管，大拇指壓在試管上，斜面向上；E、右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)部分燒紅滅菌，環(huán)以上凡在接種可能進入試管內部分，均應經過火焰灼燒。（見圖4）實驗五無菌操作及接種技術專家講座第9頁圖4接種環(huán)滅菌實驗五無菌操作及接種技術專家講座第10頁以下操作，需要使管口靠近火旁F、用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞；G、以火焰灼燒管口，灼燒時應不停轉動試管口，使試管口沾染少許菌得以燒死；H、將燒過接種環(huán)伸入菌種試管內，先將環(huán)接觸沒有長菌培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種菌體，然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管（圖5），注意盡可能不要使環(huán)部分碰釘子到管壁，取出后不可使環(huán)經過火焰；實驗五無菌操作及接種技術專家講座第11頁圖5從一個試管移種到另一試管實驗五無菌操作及接種技術專家講座第12頁I、快速將接種環(huán)在火焰旁伸進另一試管，在斜面培養(yǎng)基上從底部劃線到頂部，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種沾染管壁；J、取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞塞上，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運到時灌入不潔空氣，K、將接種環(huán)在火焰上再灼燒滅菌，放回原出后，再騰出手來將棉塞塞緊，將新接種斜面試管放在試管架上；L、接種后斜面培養(yǎng)基，放在恒溫箱內培養(yǎng)。實驗五無菌操作及接種技術專家講座第13頁斜面接種示意圖實驗五無菌操作及接種技術專家講座第14頁A、加熱融化培養(yǎng)基將三角瓶瓶口包扎繩解開，輕輕旋動棉塞，然后將瓶子放入微波爐中加熱，選取高火力，加熱1min后取出晃動，重復加熱直至培養(yǎng)基完全溶解。B、倒平板

右手持盛培養(yǎng)基三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕地撥出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，快速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。2）、平板接種技術實驗五無菌操作及接種技術專家講座第15頁實驗五無菌操作及接種技術專家講座第16頁

接種方法：A右手持接種環(huán)，經火焰滅菌，待涼后，挑取培養(yǎng)物少許。左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，往返劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積1/10），劃線時接種環(huán)與平板表面成30~40o角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，接種環(huán)不應劃破培養(yǎng)基表面。 B、燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線，約占平板表面1/5左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線……以一樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。 C、劃線完成，蓋上平皿蓋，底面向上，用標簽或臘筆注明菌名檢驗號碼，接種者信息等，置37℃孵育培養(yǎng)二十四小時后觀察結果。實驗五無菌操作及接種技術專家講座第17頁※劃線接種目標：使混合細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，方便取得純菌、活菌計數(shù)。方法：★分區(qū)劃線法：適合用于含菌量較多標本★連續(xù)劃線法：適合用于含菌量較少標本實驗五無菌操作及接種技術專家講座第18頁※劃線接種