微生物與制藥微生物與制藥第1頁(yè)藥品抗菌試驗(yàn)

藥品體外抗菌試驗(yàn)包含用于區(qū)分藥品是抑菌或殺菌藥品抑菌試驗(yàn)；測(cè)定藥品殺菌活性殺菌試驗(yàn)；以及檢驗(yàn)兩種藥品聯(lián)合作用聯(lián)合抗菌試驗(yàn)等。普通抑菌藥品只能抑制微生物生長(zhǎng)，不能殺死微生物，抑菌藥品被除去，微生物又能夠恢復(fù)繼續(xù)生長(zhǎng)。殺菌藥品能殺死微生物，殺菌藥品除去后，微生物依然不能生長(zhǎng)。微生物與制藥第2頁(yè)藥品抑菌作用或殺菌作用是在一定條件下相對(duì)而言。在咱們檢測(cè)時(shí)，藥品作用受到用藥時(shí)培養(yǎng)基組成、溫度、PH值及所用菌種、菌量等各個(gè)原因相關(guān)。即使說(shuō)體外抗菌試驗(yàn)有很多優(yōu)點(diǎn)，不過(guò)因?yàn)轶w外抗菌試驗(yàn)沒(méi)有復(fù)雜體內(nèi)原因影響，所以藥品體外抗菌試驗(yàn)和體內(nèi)抗菌試驗(yàn)可能會(huì)出現(xiàn)不一致結(jié)果。所以，普通咱們?cè)隗w外對(duì)藥品進(jìn)行測(cè)試后，有效藥再要進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，假如體內(nèi)試驗(yàn)再次證實(shí)此藥有效話，才能推薦應(yīng)用到臨床。微生物與制藥第3頁(yè)第一節(jié)藥品體外抑菌試驗(yàn)一、藥品體外抑菌試驗(yàn)（一）體外抑菌試驗(yàn)藥品體外抑菌試驗(yàn)是常見(jiàn)抗菌試驗(yàn)方法，其中最常見(jiàn)方法用系列稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。微生物與制藥第4頁(yè)

稀釋法

稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種。這兩種方法都能夠用來(lái)測(cè)定藥品最小抑菌濃度（MIC）：是指該藥品能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)最低濃度，通常見(jiàn)μg∕ml或U/ml表示。詳細(xì)液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法見(jiàn)書(shū)本，固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法，又可分為平板法和斜面法。微生物與制藥第5頁(yè)2.瓊脂擴(kuò)散法

利用藥品在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)原理進(jìn)行。普通用于細(xì)菌和酵母菌藥敏試驗(yàn)。1.

濾紙片法（紙碟法）濾紙片法是最常見(jiàn)方法，適合用于新藥初篩試驗(yàn)（初步藥品是否有抗菌作用）及臨床藥敏試驗(yàn)（細(xì)菌藥品第三性試驗(yàn)、方便選擇用藥）。濾紙片分濕、干兩種，能夠在試驗(yàn)時(shí)用無(wú)菌紙片沾取藥品溶液放在含菌平板表面，也以預(yù)先做成一定濃度干燥紙片。普通來(lái)說(shuō)預(yù)先做成干燥紙片實(shí)用一些而且準(zhǔn)確一些。微生物與制藥第6頁(yè)干燥紙片制備方法：選取吸水力強(qiáng)而且質(zhì)地均勻?yàn)V紙，用打洞機(jī)制成6mm直徑圓紙片，120℃干燥滅菌2小時(shí)。然后把配制好各種適宜濃度抗生素溶液，每100張紙片加入0.5ml藥液，使它均勻浸潤(rùn)，放在無(wú)菌平皿中，37℃，使它干燥，分裝小瓶中，封口，4℃保留.普通藥敏試驗(yàn)常采取濾紙片法，咱們能夠依據(jù)抑菌圈大小，來(lái)判斷菌種對(duì)藥品敏感性，是敏感，中度敏感還是耐藥。微生物與制藥第7頁(yè)世界衛(wèi)生組織要求了抗菌藥品敏感性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下依據(jù)抑菌圈大小來(lái)判斷，比如：抗生素或化療藥品抑菌圈直徑（mm）耐藥中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18紅霉素≤1314-17≥18四環(huán)素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18微生物與制藥第8頁(yè)2.

打洞法含菌瓊脂平板上打洞,所以說(shuō)微量法適于藥品血濃度監(jiān)測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是微量（血清用量少）敏感，操作簡(jiǎn)便。除此之外還有管碟法、直接滴加法和挖溝法：適合用于測(cè)試一個(gè)藥品對(duì)幾個(gè)細(xì)菌抗菌作用。方法是先制備普通瓊脂平板，并在平板上挖直溝，在溝內(nèi)滴加藥液，在溝側(cè)接種細(xì)菌。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后觀察加細(xì)菌生長(zhǎng)情況。咱們能夠依據(jù)溝和細(xì)菌間抑菌距離長(zhǎng)短，來(lái)判斷該藥品對(duì)這些細(xì)菌抗菌能力。微生物與制藥第9頁(yè)(二）、

體外殺菌試驗(yàn)殺菌試驗(yàn)是用來(lái)評(píng)價(jià)藥品對(duì)微生物致死活性。1.

最低殺菌濃度（MBC）（最小致死濃度MLC）測(cè)定按液體培養(yǎng)基稀釋法操作方法測(cè)了藥品MIC。然后把未長(zhǎng)出菌各個(gè)試管培養(yǎng)液分別移種到無(wú)菌平板上，培養(yǎng)后凡是平板上無(wú)菌生長(zhǎng)藥品最低濃度就是最小致死濃度（MLC）。假如是細(xì)菌話能夠稱為最小殺菌濃度（MBC）。微生物與制藥第10頁(yè)2.

活菌計(jì)數(shù)法

將定量試驗(yàn)菌加入到一定濃度定量藥品中，作用一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)數(shù)，從存活微生物數(shù)量計(jì)算出藥品對(duì)試驗(yàn)菌致死率，從而判斷藥品殺菌能力。活菌計(jì)數(shù)普通是將定量藥品與試驗(yàn)菌作用后混合液稀釋后，混入瓊脂培養(yǎng)基做成平板，培養(yǎng)后數(shù)平板上形成菌落數(shù)，因?yàn)橐粋€(gè)菌落是由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)，所以能夠用菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出混合液中存活細(xì)菌數(shù)。或者也能夠用微孔濾膜過(guò)濾藥品與試驗(yàn)菌混合液，洗凈藥液，將濾膜放在平板上培養(yǎng)后數(shù)菌落數(shù)（CFU)。微生物與制藥第11頁(yè)3.

酚系數(shù)測(cè)定（石炭酸系數(shù)測(cè)定）酚系數(shù)是以酚為標(biāo)準(zhǔn)，將待測(cè)化學(xué)消毒劑與殺菌效力相比較，所得就是殺菌效力比值。苯酚系數(shù)=消毒劑殺菌稀釋度/苯酚殺菌稀釋度（苯酚系數(shù)大于2或等于2才合格）因?yàn)楦鞣N化學(xué)消毒劑殺菌原理各不相同，因而這種方法僅僅適合用于酚類消毒劑殺菌效力測(cè)定。詳細(xì)測(cè)定方法:是分別將酚及待測(cè)化學(xué)消毒劑按不一樣百分比稀釋，各取5ml放到試管中，再加入經(jīng)二十四小時(shí)培養(yǎng)后菌懸液各0.5ml，混勻后放入20℃水浴中，5、10、15分鐘分別取一接種環(huán)混合液移種到另一支5ml肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)二十四小時(shí)統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。微生物與制藥第12頁(yè)（三）、

聯(lián)合抗菌試驗(yàn)1、聯(lián)合抗菌試驗(yàn)主要用于測(cè)定兩種抗菌藥品聯(lián)合應(yīng)用時(shí)相互影響。①無(wú)關(guān)作用小，兩種藥品聯(lián)合作用活性等于其單獨(dú)活性；②拮抗作用，兩種藥品聯(lián)合作用顯著低于單獨(dú)抗菌活性；③累加作用，兩種藥品聯(lián)合作用時(shí)活性等于兩種單獨(dú)抗菌活性之和；④協(xié)同作用，兩種藥品聯(lián)合作用顯著大于其單獨(dú)作用總和。微生物與制藥第13頁(yè)常見(jiàn)方法

1.

棋盤格法棋盤稀釋法是常見(jiàn)定量方法，首先分別測(cè)定擬聯(lián)合抗菌藥品對(duì)檢測(cè)菌MIC。藥品稀釋分別在方陣縱列和橫列進(jìn)行，這么在每管（孔）中可得到不一樣濃度組合兩種藥品混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h后觀察結(jié)果。計(jì)算個(gè)別抑菌濃度（FIC）指數(shù)0．5為協(xié)同作用；0．5－1為相加作用；1～2為無(wú)關(guān)作用；＞2為拮抗作用。

微生物與制藥第14頁(yè)[棋盤法設(shè)計(jì)]棋盤法主要優(yōu)點(diǎn)在于甲、乙兩藥每個(gè)藥品濃度都有單獨(dú)和與另一個(gè)藥品不一樣濃度聯(lián)合，所以能準(zhǔn)確測(cè)定兩種抗菌藥品在適當(dāng)濃度百分比下所產(chǎn)生相互作用。在進(jìn)行棋盤法之前應(yīng)先測(cè)定兩種抗菌藥品單獨(dú)對(duì)受試菌MIC，然后以兩藥MIC8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC1/2、1/4、1/8濃度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4濃度）分別進(jìn)行聯(lián)合?？梢?jiàn)舉例，如表—1青霉素G與鏈霉素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)和表2TMP+SMZ聯(lián)合作用。微生物與制藥第15頁(yè)藥品及濃度青霉素G(IU／m1)鏈霉素單藥對(duì)照4210.50.25鏈霉素（μg／ml）64------32------16------8---+++4---+++青霉素G單藥對(duì)照---++細(xì)菌對(duì)照-：無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)+：有細(xì)菌生長(zhǎng)FIC指數(shù)=1／1+16／16=2——無(wú)關(guān)微生物與制藥第16頁(yè)

2.紙條試驗(yàn)

在含菌平板上垂直放兩條浸有不一樣藥液濾紙條，培養(yǎng)后觀察兩藥形成抑菌區(qū)圖形來(lái)判斷兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，是無(wú)關(guān)、協(xié)同還是拮抗作用。

微生物與制藥第17頁(yè)3.

紙條梯度平板試驗(yàn)

將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培養(yǎng)基。將平皿放平加入含抗菌藥品瓊脂培養(yǎng)基，這么在制成雙層瓊脂平板中含有梯度濃度抗菌藥品。要求其最小抑菌濃度位置約處于平板二分之一。然后將試驗(yàn)菌液均勻涂布在平板表面。取紙條浸透另一待檢藥液，按梯度中藥品濃度遞減方向置于平板表面，培養(yǎng)后觀察形成抑菌區(qū)圖形以判斷兩種藥品之間相互作用。微生物與制藥第18頁(yè)意義目標(biāo)在于：①治療混合性感染；②預(yù)防或推遲細(xì)菌抗生素耐藥性發(fā)生；③聯(lián)適用藥能夠降低劑量以防止到達(dá)毒性劑量；④聯(lián)適用藥比單一用藥時(shí)效果更加好。微生物與制藥第19頁(yè)二、藥品體內(nèi)抗菌試驗(yàn)

藥品體內(nèi)抗菌試驗(yàn)又稱為動(dòng)物試驗(yàn)治療試驗(yàn)或保護(hù)力試驗(yàn)。當(dāng)抗菌藥品進(jìn)入機(jī)體后，其效力發(fā)揮要受體內(nèi)各種原因影響。如血液及組織內(nèi)蛋白質(zhì)或磷脂、膿汁內(nèi)核酸均與藥品結(jié)合，降低藥品活性；壞死組織內(nèi)酸性環(huán)境也能影響藥品活性。機(jī)體內(nèi)微生物，代謝活動(dòng)較低，對(duì)藥品敏感性降低，有時(shí)還可形成細(xì)胞壁缺點(diǎn)型細(xì)菌，對(duì)一些藥品不敏感。機(jī)體內(nèi)各組織中藥品吸收，分布不一樣，使藥品濃度難以恒定。所以在評(píng)定新藥藥效時(shí)除做體外抗菌試驗(yàn)外還需要做體內(nèi)抗菌試驗(yàn)。

微生物與制藥第20頁(yè)三、影響抗菌試驗(yàn)原因

1.

菌種在抗菌試驗(yàn)中所用到菌種，必需是國(guó)家衛(wèi)生部生物制品檢定所菌各保藏中心專門提供標(biāo)準(zhǔn)菌株。在特殊情況下，也能夠采取臨床新分離并經(jīng)過(guò)判定、純化及合理保藏菌株。而且咱們要用到試驗(yàn)菌種應(yīng)該選擇是對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)菌。因?yàn)槟菚r(shí)菌種生命力最旺盛，這對(duì)于我試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果也會(huì)準(zhǔn)確些。微生物與制藥第21頁(yè)1.

培養(yǎng)基試驗(yàn)所用到培養(yǎng)基應(yīng)按各試驗(yàn)菌營(yíng)養(yǎng)要求進(jìn)行配制，嚴(yán)格控制各種原料、成份質(zhì)量及培養(yǎng)基配制過(guò)程。要注意當(dāng)有些藥品含有抗代謝作用時(shí)，培養(yǎng)應(yīng)不能存在代謝物，不然抑菌作用將會(huì)被消除。培養(yǎng)基內(nèi)假如含有血清等蛋白質(zhì)時(shí)，有可能與一些抗菌藥品結(jié)合，使抗菌藥品失去，所以就要防止培養(yǎng)基混進(jìn)這類營(yíng)養(yǎng)物。微生物與制藥第22頁(yè)3.

抗菌藥品藥品物理狀態(tài)、濃度、稀釋方法等都會(huì)直接影響抗菌試驗(yàn)結(jié)果，必需準(zhǔn)確配制。假如是固體藥品，必需使藥品溶解或使藥品呈均勻懸液。PH值應(yīng)調(diào)至中性，以確保藥品穩(wěn)定性和不影響細(xì)菌生長(zhǎng)。中草藥因?yàn)橛蓄伾秃绪焚|(zhì)，結(jié)果判斷，應(yīng)尤其注意。微生物與制藥第23頁(yè)4.

對(duì)照試驗(yàn)為確保試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)性和準(zhǔn)確性，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行各種對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)菌對(duì)照：在無(wú)藥情況下，應(yīng)能在培養(yǎng)基內(nèi)正常生長(zhǎng)。溶劑及稀釋液對(duì)照：配制抗菌藥品時(shí)所用溶劑及稀釋液均應(yīng)無(wú)抗菌作用。已知藥品對(duì)照：應(yīng)使已知抗菌藥品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)抗菌效應(yīng)。

微生物與制藥第24頁(yè)復(fù)習(xí)題：1.

藥品體外抑菌試驗(yàn)常見(jiàn)方法有哪幾個(gè)？詳細(xì)試驗(yàn)操作方法？

2.

怎樣測(cè)定藥品最小致死濃度？

3.

聯(lián)合抗菌試驗(yàn)常見(jiàn)方法有哪些？

4.

藥品體內(nèi)抗菌試驗(yàn)方法？

5.

抗菌試驗(yàn)影響原因有哪些？微生物與制藥第25頁(yè)試驗(yàn)細(xì)菌對(duì)藥品敏感性試驗(yàn)（藥敏片擴(kuò)散法）目標(biāo)意義：

掌握藥敏片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)普通方法體會(huì)藥敏試驗(yàn)在臨床用藥上指導(dǎo)意義基礎(chǔ)原理：

藥敏片是含有抗生素濾紙片，將其置于涂滿待測(cè)菌固體培養(yǎng)基上，抗菌藥品經(jīng)過(guò)向培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)。依據(jù)抑菌環(huán)大小能夠判定細(xì)胞對(duì)此藥品敏感度。微生物與制藥第26頁(yè)器材及試劑:藥敏片：含各種抗生素市售產(chǎn)品培養(yǎng)基平板：普通牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，待檢細(xì)菌培養(yǎng)物。眼科鑷、無(wú)菌棉拭子、酒精燈等。微生物與制藥第27頁(yè)試驗(yàn)步驟:1、用無(wú)菌棉拭子沾取小量待測(cè)菌液，均勻涂布平板，待稍干后，用無(wú)菌眼科鑷將各種藥敏片分別平貼在平板培養(yǎng)基表面，每板4-6個(gè)，相互間應(yīng)有一定距離（15mm）。2、置37℃，培養(yǎng)8-12h，觀察結(jié)果。3、結(jié)果判定：觀察有沒(méi)有抑菌圈及測(cè)量其直徑，按下表判定對(duì)藥品敏感性。微生物與制藥第28頁(yè)中國(guó)藥典二部微生物程度標(biāo)準(zhǔn)(單位：個(gè)/g或個(gè)/ml)