第二章臨床生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室基本技術(shù)與實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理第一節(jié)常用臨床生物化學(xué)分析技術(shù)第二節(jié)常用免疫分析技術(shù)(自學(xué))第三節(jié)生物芯片和生物傳感技術(shù)第四節(jié)酶蛋白分離純化技術(shù)(自學(xué))第一頁，共二十二頁。第一節(jié)常用臨床生物化學(xué)分析技術(shù)一、光譜分析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)(了解)四、層析技術(shù)五、電化學(xué)分析技術(shù)第二頁，共二十二頁。一、光譜分析技術(shù)(一)吸收光譜分析法(二)發(fā)射光譜分析法(三)散射光譜分析法第三頁，共二十二頁。(一)吸收光譜分析法1.原理：利用物質(zhì)吸收光譜譜系特征，確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)。2.方法學(xué)評價(jià)優(yōu)點(diǎn)：(1)靈敏度高，檢測濃度在10-5~10-2

mol/l范圍。(2)操作簡便、快速、選擇性好和應(yīng)用廣泛。(3)原子吸收分光光度法使用空心陰極燈作光源，譜線簡單，由譜線重疊引起的干擾小(4)原子吸收分光光度法自動化程度高，在復(fù)雜樣品分析中，可直接測定多種元素。

缺點(diǎn)：(1)比色法需有標(biāo)準(zhǔn)品，有些反應(yīng)的顯色劑本身顏色會影響測定方法的靈敏度和特異性。(2)紫外法的吸收池需用石英玻璃作光學(xué)面。(3)原子法需特定元素的空心陰極燈，對難熔元素測定的靈敏度不夠理想。CONTINUE第四頁，共二十二頁。3.類型：可見光及紫外光、原子吸收分光光度法(參考方法)

4.臨床應(yīng)用

（1）可見光及紫外光法多用于酶試劑終點(diǎn)法及化學(xué)法測定的項(xiàng)目

（2）原子吸收分光光度法中用于Ca2+、Mg2+定值或參考方法返回第五頁，共二十二頁。(二)發(fā)射光譜分析法1.原理：利用物質(zhì)發(fā)射光譜特征，來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)。2.類型：熒光分析法：靈敏度高，檢測范圍廣，臨床常用。火焰光度法：操作煩瑣，干擾因素多，已淘汰。3.影響熒光強(qiáng)度的因素：

(1)溶劑。與熒光強(qiáng)度成反比。(2)熒光物質(zhì)的濃度。F=I，I是激發(fā)光強(qiáng)度。濃度很小且厚度不變時(shí)成正比。反之，則反比。(3)溫度。多數(shù)情況下，與熒光強(qiáng)度成反比。(4)溶液pH。不定。4.方法學(xué)評價(jià)：靈敏度高、選擇性好、取樣量少，但干擾因素較多。5.臨床應(yīng)用：糖類、胺類、DNA與RNA酶與輔酶，Vit類及Ca2+、Fe3+、Zn2+等。返回第六頁，共二十二頁。(三)散射光譜分析法(比濁法)1.原理：利用光線通過混懸顆粒后產(chǎn)生的散射光譜特征，確定其性質(zhì)…..2.類型：散射比濁法：根據(jù)光線通過混懸液后，光線減弱的程度來測定其濃度。不需特殊儀器。透射比濁法：速率和終點(diǎn)法。通過光線透過的強(qiáng)度來確定顆粒的濃度。需特殊儀器如激光比濁儀。3.影響比濁法測定的因素：

(1)混懸顆粒大小；(2)顆粒形狀；(3)混懸液的穩(wěn)定性。因此，使用比濁法必須做到：(1)溶液中顆粒的分散度盡可能相同；(2)混濁液至少10min內(nèi)保持穩(wěn)定。4.臨床應(yīng)用：免疫球蛋白、載脂蛋白、補(bǔ)體、ASO、RF等。返回第七頁，共二十二頁。二、電泳技術(shù)(一)原理：利用帶電粒子在電場中向所帶電荷相反的電極移動的性能，對物質(zhì)分子進(jìn)行分析測定。(二)電泳技術(shù)的分類與特點(diǎn)1.移動界面電泳(movingboundaryelectrophoresis)：已淘汰。2.區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis)：一類是濾紙、醋酸纖維素膜、硅膠等；一類是淀粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠等。其中后者的優(yōu)點(diǎn)是：(1)使用細(xì)微多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)支持介質(zhì)，可消除電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)使分辨率提高；(2)幾乎不吸附蛋白質(zhì)，電泳無拖尾現(xiàn)象；(3)蛋白質(zhì)在低濃度瓊脂糖膠電泳時(shí)可自由穿透，阻力小，透明度高，敏感性高。因此，取代第一類電泳。CONTINUE第八頁，共二十二頁。(三)方法學(xué)評價(jià)設(shè)備簡單，操作方便，具較高的分辨率及選擇性，不足之處是干擾因素較多。(四)電泳技術(shù)的影響因素顆粒性質(zhì)，電場強(qiáng)度，溶液性質(zhì)，pH值，離子強(qiáng)度，溶液粘度，電滲和支持物等。(五)區(qū)帶電泳的臨應(yīng)用測定項(xiàng)目有：血清蛋白、血紅蛋白、糖化血紅蛋白、腦脊液和尿液蛋白、脂蛋白及脂蛋白(a)、LDH、ALP、CK的同工酶及亞型。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳可分離的項(xiàng)目包括：多肽、氨基酸、DNA、酶分子等。研究熱點(diǎn)。返回第九頁，共二十二頁。四、層析技術(shù)(一)原理：利用固定相和流動相理化性質(zhì)的差異而建立起來的分析技術(shù)。當(dāng)流動相(待分離物質(zhì))經(jīng)過固定相時(shí)，由于各組分的理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用(吸附、結(jié)合)的能力不同，在兩相中的分配不同，隨著流動相的推進(jìn)，各組分在兩相中進(jìn)行不斷再分配。與固定相作用弱的組分，受到阻力小，向前移動速度快，反之，移動速度慢，從而達(dá)到將樣品中各單一組分分離的目的。(二)層析技術(shù)的類型：

1.按兩相所處狀分：液-液層析法、液固層析法、氣-液層析法、氣-固層析法

2.按操作模式不同分：柱層析法、薄層析法、紙層析法、薄膜層析法

3.按層析原理分：吸附層析法---固定相是固體吸附劑

分配層析法---固定相是靜止的液體CONTINUE第十頁，共二十二頁。

離子交換層析法------固定相是離子交換劑

凝膠層析法------固定相是多孔凝膠親和層析法------固定相可以是固體、液體或凝膠，但只能與一種待分離的成份專一結(jié)合。(三)層析法的特點(diǎn)及應(yīng)用層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，故適用于雜質(zhì)多，含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。具體如下：1.凝膠層析法

(1)特點(diǎn)：固定相為惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。

(2)應(yīng)用：脫鹽；分離提純；測定高分子物質(zhì)的分子量；高分子溶液的濃縮。CONTINUE第十一頁，共二十二頁。2.離子交換層析法

以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用流動相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。臨床應(yīng)用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及同工酶等。3.高效液相層析法(highperformanceliquidchromatography)(1)優(yōu)點(diǎn)：分離能力強(qiáng)，測定靈敏度高，強(qiáng)在室溫下進(jìn)行，應(yīng)用范圍極廣。(2)HPLC的類型：液-固吸附層析；液-液分配層析；離子交換層析。(3)臨床應(yīng)用：多用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和脂類等的分離。4.親和層析法利用待分離物質(zhì)與配體間所具有的特異性親和力，達(dá)到分離目的一類特殊層析技術(shù)。如抗原與抗體、DNA與RNA、酶與底物或抑制物等。主要用于純化生物分子。返回第十二頁，共二十二頁。五、電化學(xué)分析技術(shù)(一)定義：利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測定化學(xué)電池的電位、電流或電量變化的方法。包括電位分析法(potentialmethod)、電導(dǎo)分析法和電容量分析法等。電位分析法：是利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法。而離子選擇性電極分析法(ionselectiveelectrode，ISE)則是電位分析法中發(fā)展最為活躍的分支。(二)離子選擇性電極法的電極類型

1.玻璃膜電極如H+、Na+等。

2.氣敏電極

3.酶電極(enzymeelectrode)(三)臨床應(yīng)用用在電解質(zhì)分析儀上，測定K+、Na+、Cl-、Ca2+

等。返回第十三頁，共二十二頁。第三節(jié)生物芯片和生物傳感技術(shù)一、生物芯片技術(shù)生物芯片(biochip)是指由微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建而成的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)。其特點(diǎn)是高通量、微型化和自動化，可以對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。二、生物傳感技術(shù)生物傳感技術(shù)(biosensor)是由生物活性材料與相應(yīng)的換能器結(jié)合而成的結(jié)合體，能測定多種特定的生物化學(xué)物質(zhì)。第十四頁，共二十二頁。一、生物芯片技術(shù)(一)原理：把制備好的生物樣品固定于經(jīng)過化學(xué)修飾的載體上，樣品中的生物分子與載體表面結(jié)合(保留其理化性質(zhì))，在一定條件下，與芯片上的生物分子發(fā)生反應(yīng)，并使反應(yīng)達(dá)最佳狀態(tài)，然后利用芯片專用監(jiān)測系統(tǒng)對芯片信號進(jìn)行監(jiān)測，即可高效、大量獲取待檢物質(zhì)的信息。(二)生物芯片類型按固定的生物分子及材料不同可分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室等。其中臨床生物化學(xué)常用的有基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室三類。

1.基因芯片(genearrays)是通過檢測基因的豐度來確定基因的表達(dá)模式和表達(dá)水平。

2.蛋白質(zhì)芯片(proteinarrays)，指把制備好的蛋白質(zhì)樣品固定于經(jīng)過化學(xué)修飾后的玻片、硅片等載體上，蛋白質(zhì)與載體表面結(jié)合，但仍保留蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物活性的分析系統(tǒng)。CONTINUE第十五頁，共二十二頁。3.芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-chip)是指將生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的分析功能濃縮固定在生物芯片上所形成的分析系統(tǒng)。(三)生物芯片技術(shù)要點(diǎn)1.芯片制備常用的芯片基底(即芯片載體)是玻璃片和硅片。制芯片過程有：(1)首先利用表面化學(xué)方法或組合化學(xué)方法對芯片基底(載體)進(jìn)行處理(修飾)；(2)然后將蛋白質(zhì)分子(純化后的)按順序排列在芯片上。主要是利用自動點(diǎn)樣裝置將不同的蛋白質(zhì)固化在載體的表而，用這種裝置，半塊載玻片就可固定10000多種蛋白質(zhì)。點(diǎn)樣的關(guān)鍵是既要保證芯片載體上的蛋白質(zhì)分不失活，又要能夠牢固的固定在載體表面。根據(jù)對芯片載體的處理方法，芯片可有以下幾種類型：蛋白質(zhì)微陳列芯片----用于研究蛋白質(zhì)；微孔板蛋白質(zhì)芯片；三維凝膠塊芯片---用于研究抗原抗體、酶動力學(xué)。CONTINUE第十六頁，共二十二頁。2.樣品的制備(1)首先利用同位素標(biāo)記法、或酶標(biāo)記法或熒光標(biāo)記法對待測樣品進(jìn)行標(biāo)記；(2)然后通過在芯片上制作的微型樣品處理系統(tǒng)(如介電電泳)，將標(biāo)記的待測樣品從復(fù)雜的混合體中分離出來。3.生物分子的反應(yīng)選擇合適的反應(yīng)條件，如溫度、pH、抗體濃度等使生物分子之間的反應(yīng)處于最佳狀態(tài)，以提高檢測的靈敏度和特異性。反應(yīng)類型如抗原抗體反應(yīng)、受體配體反應(yīng)、DNA與互補(bǔ)DNA或RNA的反應(yīng)、酶與底物或抑制劑的反應(yīng)等。

4.芯片信號的檢測(1)芯片專用監(jiān)測系統(tǒng)，scanArray5000;(2)全自動免疫分析儀，用于監(jiān)測微孔板蛋白質(zhì)芯片。(四)生物芯片技在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1.用于臨床疾病的診斷：如腫瘤、糖尿病、傳染性疾病等。CONTINUE第十七頁，共二十二頁。2.基因排序分析3.藥物篩選：從蛋白質(zhì)水平或基因水平尋找藥物靶標(biāo)，解釋藥物的作用機(jī)制。(五)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的質(zhì)譜和雙向凝膠電泳技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)：1.能夠快速定量分析大量的蛋白質(zhì)。2.操作較簡單，只須標(biāo)本進(jìn)行沉降分離后，就可加在芯片上進(jìn)檢測分析。3.樣本用量少，結(jié)果正確率高。4.與酶標(biāo)ELISA相比，蛋白質(zhì)芯片采用光敏染料標(biāo)記，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。5.所需試劑少，實(shí)用性較強(qiáng)。返回第十八頁，共二十二頁。二、生物傳感技術(shù)(一)原理：待測物質(zhì)分子經(jīng)擴(kuò)散作用，進(jìn)入固化生物敏感膜層，發(fā)生特異的生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息被相應(yīng)的物理或化學(xué)換能器轉(zhuǎn)變成可定量或可處理的電信號，再經(jīng)過2次脈沖放大輸入到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，就可算出待測物的濃度。1.生物敏感膜又稱為分子識別元件。是采用固定化技術(shù)將酶等生物活性物質(zhì)限制在一定的空間，而又不妨礙它們自由擴(kuò)散的人工膜。固化生物活性物質(zhì)與游離相比優(yōu)點(diǎn)有：(1)熱穩(wěn)定性提高；(2)可重復(fù)使用；(3)不需要在反應(yīng)后進(jìn)行催化物質(zhì)與反應(yīng)物的分離；(4)可根據(jù)已知的halflife來確定生物膜的壽命；(5)能夠避免外源性微生物對生物功能物質(zhì)的污染和降解等。2.生物學(xué)反應(yīng)和換能器CONTINUE第十九頁，共二十二頁。(二)生物傳感技術(shù)的分類1.按分子識別元件的不同可分為：酶傳感器(enzymesensor)、微生物傳感器(microbial)、免疫傳感器(immune)、組織傳感器(tissue)和細(xì)胞器傳感器(organell)2.按所用換能器不同分為：生物電極、半導(dǎo)體生物傳感器、光生物傳感器(opticalbiosensor)、熱生物傳感器、壓電晶體生物傳感器。3.目前流行的分類法：微型生物傳感器--用于活體測定

親和生物傳感器------免疫電極、酶電極

多功能生物傳感器-----血液成分傳感器