實驗二

血凝及血凝抑制實驗

目前一頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點實驗目的

１血凝試驗：滴定病毒的血凝效價(病毒的凝集價)，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位。２血凝抑制試驗：應用標準病毒液測定血清中的相應抗體或應用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒．３檢測實驗用雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。４掌握基本操作技術(shù),了解其實用價值．

目前二頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點實驗原理

目前三頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝素（HA）柱狀流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖目前四頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點刺突：亞型特異性抗原，易變異

血凝素（HA，從H1—H15):呈柱狀

功能：①吸附細胞：與細胞上受體結(jié)合,使病毒侵入細胞②凝集多種動物的紅細胞（血凝試驗）③具抗原性：其抗體能中和病毒---中和抗體抑制血凝（血凝抑制試驗）目前五頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝試驗原理血凝素（hemagglutininHA）：由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。與病毒吸附和傳入宿主細胞有關(guān)。HA能與人或其它動物多種紅細胞表面N－乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細胞凝集。為病毒的紅細胞凝集反應或血凝反應。目前六頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝原理血凝抑制原理目前七頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝抑制試驗原理

病毒引起的血凝現(xiàn)象能被相應的抗血凝素抗體所抑制，即抗體與病毒結(jié)合后，血凝素無法吸附于紅細胞表面的受體上，用免疫血清阻止紅細胞凝集的現(xiàn)象，稱為血凝抑制．

目前八頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點實驗材料器材：U型或V型微量反應板、微量移液器、槍頭試劑：1%雞紅細胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理鹽水目前九頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點實驗步驟1.取96孔V型反應板1塊置于水平實驗臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水2.在第1孔內(nèi)加入血凝素25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。目前十頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點目前十一頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點3.在1-12孔均加入25ul的生理鹽水。4.在每孔內(nèi)加入25ul1%的雞紅細胞懸液，震蕩，室溫靜止感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。5.計算血凝效價，稀釋使成為四價備用．目前十二頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝試驗結(jié)果判定效價判定：凝集特別顯著：“＋＋＋＋”凝集現(xiàn)象次之：“＋＋＋”凝集清楚可見：“＋＋”稍顯凝集者：“＋”血凝效價：呈“＋＋”凝集時的最高稀釋度。此時的稀釋度即為1個血凝單位。目前十三頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點結(jié)果判定1.在各組對照均正確的情況下，按下列標準判定

血凝反應強度示意圖“4＋”紅細胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時不整齊或皺縮?！?＋”紅細胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”。“2＋”紅細胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點狀?！埃奔t細胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒?！埃奔t細胞均沉于孔底呈小圓點狀，邊緣整齊。2.對照孔正常的情況下，紅細胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價的終點。凡能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價。目前十四頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝抑制1.取96孔V型反應板1塊置于水平實驗臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水。2.在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。目前十五頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點目前十六頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點3.在1-12孔內(nèi)均加入“四價”血凝素25ul，震蕩后，室溫靜止作用5min。4.在1-12孔內(nèi)均加入1%的雞紅細胞懸液25ul，震蕩，室溫感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。5.觀測結(jié)果，記錄實驗數(shù)據(jù)．目前十七頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點血凝抑制試驗結(jié)果判定測定孔RBC沉于孔底中心，呈紐扣狀。(+)

凝集（-）病毒對照孔：凝集RBC對照孔：無自凝血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度。

目前十八頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點目前十九頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點目前二十頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點思考題1、病毒凝集紅細胞是不是一種特異的抗原體反應？為什么？2、血凝抑制實驗是不是特異的抗原抗體反應?為什么？3、血凝試驗中為什么要加補充液？4、為什么加病毒液和紅細胞懸液時要反向加？5、血凝試驗和血凝抑制試驗中空白對照的意義？目前二十一頁\總數(shù)二十四頁\編于十九點孔號1234567891011(+)12（-)HA稀釋度248163264128256、、、、棄生理鹽25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理鹽水2525252525252525252525251%雞紅細胞252525252525252525252525結(jié)果預測++++++++++++++++++++++++++--++++_孔號1234567891011(+)12（-)HI稀釋度248163264128256、、、、棄生理鹽25252525252525252525X25待檢血清2525252525252525252525x4HA血凝素252525252525252525252525