微滴式數(shù)字PCR技術(shù)原理及質(zhì)量控制吳非

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Ph.DBio-RadAPMPCR技術(shù)的演化1st2nd3rd常規(guī)PCR定性定量PCR相對(duì)定量數(shù)字PCR絕對(duì)定量Life

scienceresearch微滴式數(shù)字（ddPCR）技術(shù)原理和優(yōu)勢(shì)無需標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量更高的數(shù)據(jù)精密度04050601（腫瘤分子標(biāo)志物的定量檢測(cè)）（能識(shí)別更小的濃度變化）提高對(duì)抑制物的耐受度（適應(yīng)各種臨床標(biāo)本）更好的數(shù)據(jù)重復(fù)性（利于腫瘤分子標(biāo)志物的連續(xù)監(jiān)測(cè)、室間質(zhì)評(píng)）02更高的檢測(cè)靈敏度，輕松突破0.1%突變檢出限（提升高頻野生型背景下的低頻突變檢出率）操作便捷，無需復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析（易于平臺(tái)建設(shè)和推廣）03Life

scienceresearch4QX200Droplet

Digital

PCR實(shí)驗(yàn)流程1.

生成微滴2.“油包水”

PCR3.讀取微滴Droplet

GeneratorBulk

PCRDroplet

ReaderThermal

Cycleror每次運(yùn)行生成通量：8或96個(gè)樣本體系PCR反應(yīng)及檢測(cè)通量：96個(gè)樣本體系.

結(jié)果輸出：copies/μl；動(dòng)態(tài)范圍:

5個(gè)數(shù)量級(jí)拷貝/孔(~330ng

人類基因組DNA)Life

scienceresearch數(shù)據(jù)結(jié)果輸出5.

陽性微滴含有至少1個(gè)拷貝目的核酸分子.

陽性微滴較陰性微滴有更高的熒光強(qiáng)度值.

QuantaSoft?軟件對(duì)每個(gè)樣本兩個(gè)熒光通道的陽性、陰性微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)陽性微滴陰性微滴Life

scienceresearch定量原理：泊松分布如果平均每個(gè)微滴中靶標(biāo)分子數(shù)（Copies

perdroplet,CPD）較大（>0.1）；一些微滴中出現(xiàn)2個(gè)或更多靶標(biāo)分子（靶標(biāo)數(shù)>陽性微滴數(shù)）；需要如何對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行定量？eλ

kλ泊松分布模型P(X

k)

k!Copies

per

droplet

=

–ln(1–

p)p為陽性微滴百分比；(1–

p)

為陰性微滴百分比注意:

CPD為2.5（即50,000拷貝靶標(biāo)）時(shí)，仍有8.21%陰性微滴！SiméonDenis

Poisson(1781-1840)0123456789

10#targetmoleculesLife

scienceresearchddPCR應(yīng)用于腫瘤學(xué)和液體活檢中的意義ddPCR對(duì)于已知用藥意義的腫瘤分子標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量檢測(cè)，為腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療提供信息，參與腫瘤病人的全程管理。?

早期篩查Molecular

Cancer201716:80Challenge

of

ctDNAdetection?

克服腫瘤組織異質(zhì)性（時(shí)間/空間）?

腫瘤分子分型?

轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或進(jìn)展的預(yù)測(cè)?

療效實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和評(píng)估?

微小殘留病檢測(cè)researchddPCR結(jié)果穩(wěn)定可重復(fù)——國際室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

參與實(shí)驗(yàn)室：21(北美/歐洲)

檢測(cè)樣本量：4(不同突變比例最低0.17%

）

評(píng)估靶標(biāo)：KRASG12D

檢測(cè)方法

：ddPCR(QX100/200)ddPCR針對(duì)稀有SNV檢測(cè)數(shù)據(jù)具有高度的重復(fù)性WhaleAS.,et

al.,

Anal

Chem,2017,

89(3):

1724-1733Life

scienceresearch2017年第18屆世界肺癌大會(huì)（WCLC_IASLC）2017

年

10

月

15

日～18

日日本

橫濱Detection

of

EGFR

T790M

Mutations

byFour

TestingPlatforms

inctDNA

fromChinese

Patients

with

Advanced

NSCLC張緒超

教授中國晚期NSCLC患者血清EGFR

T790M突變檢測(cè)平臺(tái)的比較廣東省肺癌研究所??研究顯示，Cobas、SuperARMS、NGS、cdPCR突變陽性率檢出率分別為37%、42%、54%、64%；以Cobas為參照，NGS檢測(cè)敏感度達(dá)到99%，SuperARMS檢測(cè)一致性和特異性最高，分別為91%和89%。而cdPCR具有較低的特異性和一致性，分別為52%和67%。Gefitinib

asFirst-Line

Treatment

of

Plasma

ctDNA

EGFRMutation-PositiveNSCLCDetected

by

ddPCR:BENEFIT

Study

(CTONG1405)吉非替尼是經(jīng)ddPCR法檢測(cè)EGFR突變陽性NSCLC患者的一線治療方案王潔

教授中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院?

BENEFIT研究是目前第一項(xiàng)前瞻性的臨床研究，進(jìn)一步明確了ctDNA

EGFR突變指導(dǎo)的一線吉非替尼療效，同時(shí)探索EGFR突變等分子標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化意義。?結(jié)果顯示，ddPCR檢測(cè)的ctDNA

EGFR突變指導(dǎo)的一線吉非替尼治療的客觀有效率為72.1%，治療8周的疾病控制率為92.3%，中位PFS為9.5個(gè)月。Life

scienceresearch基于ddPCR的血液檢測(cè)流程一代TKI藥物耐藥病人專用cfDNA制穩(wěn)定可靠的檢測(cè)體系備試劑盒加樣儲(chǔ)運(yùn)建檔分離提取cfDNA采血全血血漿檢測(cè)正確的數(shù)據(jù)分析方法嚴(yán)格的質(zhì)量控制是保障檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵！結(jié)果分析檢測(cè)報(bào)告Life

scienceresearchTips:

影響ddPCR檢測(cè)準(zhǔn)確性的因素Relative

contributionof

partitioning

errorandsubsampling

error

toddPCRerrorSamplingerrorPartition

errorOthers..ddPCRerror(15,000droplets)SubsamplingerrorVolume

error.

虛線間顯示

CV%<2.5%的CPD范圍，最低CV%在

CPD=1.59..

主要誤差來自泊松分布的誤差和樣本取樣時(shí)的誤差.

增加微滴數(shù)只能擴(kuò)大動(dòng)態(tài)范圍，但不能提高檢測(cè)靈敏度！PartitioningerrorSubsamplingerror0.115.7301

1.59

23456CPDLife

scienceresearchTips:

二次取樣誤差，增加上樣量.

為確保靈敏度，需盡可能大的上樣量（影響陽性檢出率）Perfect期望測(cè)的6拷貝，但是–

3X原則（Theruleof

three）：countingmachine3/4/5/6/7/8可能會(huì)測(cè)得拷貝?

如果要在95%置信度下檢出突變豐度為1/1000的樣本，那么至少需要在檢測(cè)體系中加入3000拷貝的基因組DNA。這種不確定性被稱為二次取樣誤差，可通過泊松分布函數(shù)來描述25μL樣本中有150拷貝ctDNA，如果取1μL（1/25）用于上樣，平均6

拷貝/μLLife

scienceresearch設(shè)置嚴(yán)格對(duì)照，發(fā)現(xiàn)假陽性?

假陽性（FalsePositive

）的來源1.

交叉污染、氣溶膠2.

非特異性擴(kuò)增3.

生化反應(yīng)的隨機(jī)性4.

樣本的來源及類型避免樣本交叉污染：實(shí)驗(yàn)室管理體系的規(guī)范運(yùn)行是關(guān)鍵！分區(qū)單向物流人員操作試劑耗材清潔消毒管理體系方法學(xué)確認(rèn)規(guī)范的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)功能布局Life

scienceresearchddPCR技術(shù)本身會(huì)否造成假陽性？No！

制備好的微滴本身為獨(dú)立、封閉結(jié)構(gòu)，不會(huì)再接受外界污染，微滴制備環(huán)節(jié)不會(huì)引入假陽性結(jié)果

NTC和強(qiáng)陽性對(duì)照間隔放置結(jié)果顯示，微滴讀取過程中也不會(huì)產(chǎn)生交叉污染Life

scienceresearch16臨床樣本的檢測(cè).

每批次臨床樣本的檢測(cè)中，必須同時(shí)設(shè)置平行無模板對(duì)照(NTCs)、突變陰性對(duì)照（純合野生型對(duì)照）和突變陽性對(duì)照（純和突變型），根據(jù)對(duì)照設(shè)置閾值線.

如果未知樣本間的總DNA量差異大，建議設(shè)置多個(gè)不同DNA濃度的WT陰性對(duì)照，以評(píng)價(jià)不同背景干擾下的FRP水平NegativeControl:2,000copies/μl

of

wild-typeNo

Template

Control反應(yīng)孔數(shù)目1NTC>1

陰性對(duì)照野生型1陽性對(duì)照1每樣本Positive

Control:Unknown

sample:Expected

cluster

locations:

NTC,negative

control,

and

sampleLife

scienceresearch17陽性還是陰性？Confidentially

calling

apositive.

經(jīng)驗(yàn)方法：未知樣本檢測(cè)結(jié)果的置信區(qū)間（95%CI）與陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果的置信區(qū)間（95%CI）應(yīng)無重合.

t-檢驗(yàn)也可用于幫助判斷陽性樣本和陰性對(duì)照之間有無顯著差異Calls:NoYesYesYes[WT][MT]WT-100Sample

ASample

BWT-1000Sample

CSample

DLife

scienceresearchTakeHome

Messages?

檢測(cè)靈敏度/LoD的判讀?

影響LoD的兩個(gè)重要因素：1.

Input樣本量2.

假陽性率（FPR）?

如果Control正常，F(xiàn)P>>0陽性弱陽性陰性陽性微滴數(shù)≥3。按突變比例的公式進(jìn)行計(jì)算。陽性微滴數(shù)為1或2，且突變比率大于等于方法檢測(cè)下限。陽性微滴數(shù)=0，或突變比率小于方法檢測(cè)下限。?

根據(jù)FPR，則動(dòng)態(tài)計(jì)算LoD