的提取：1.抽提緩沖液2%CTAB(W/V)2PVPK25(w/v)〔去色素〕100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl2.10MLiCl2MLiCl3MNaAc(pH5.2)696%乙醇770%乙醇步驟：65℃預(yù)熱；〔700ul〕中混勻，65℃，10min；加酚/氯仿/異戊醇〔5：：1m，n；〔24：1〕12,000rpm，10min；4步驟；0M5倍體積的乙醇〔或參與等體積的異丙醇，－C沉淀；..100100ml水中。(二)〔我們常用的方法，但是有時(shí)有些細(xì)菌特別不好提，就用上面的方法〕LB培育基，37℃震蕩培育過夜。2min。30ul10%SDS15ulK，混1h.,6510min。/4-5min,0.6-0.8倍體積的異丙DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。DNA的提取：〔一〕0.5g,在液氮中快速研磨成粉提取液，快速振蕩混勻L的氯仿:)3n〔〕4.1000rpm，4℃，5min再抽提一次〔10,000rpm，45min〕2.5倍體積的無水乙醇沉淀,混勻,30minulTE中7.用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,500.1lA〔0L，71和氯仿:異戊醇(24:1)1次〔10,000rpm，45min〕體積的無水乙醇-7030min以上,200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆肁提取液：M〔H，Ml，MEDT，1％S，3MNaAc〔二〕g,在液氮中快速研磨成粉6530min,2-3次20min1次〔10,000rpm，45min〕-20℃預(yù)冷異丙醇,混勻,30minL6用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干重懸于0 中71lA〔0L，71和氯仿:異戊醇(24:1)1次〔10,000rpm，45min〕-7030min以上,200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆?。以上是我們常用的方法．DNA的提取方法.5ml，EDTA抗凝，2500rpm10min(2)留神吸取上層血30.5ml離心管中。(3)315min。(4)2500rpm上清。(5)參與10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。 (7)倒置離心管，去掉殘液。 凍存。2.從白細(xì)胞中提取基因組DNA(1)取白細(xì)胞，(2)0.5ml10％SDS(3)E50μl(4)首尾

3mlNaCL15秒，取出上清，放于另一管中，參與等體積的三氯甲烷，混。。10min。(11)2500rpm50ml3(13)DNA絮狀沉淀析DNA溶解，4oC保存。DNA的提取及鑒定1A的簡易方法Alllm2〔,2次〕參與樣品提取液分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)展)12023rpm5分鐘,2μl2)、從其DNA：可直接加適量的樣品提取液到裝有發(fā)根、頭屑、骨髓、精子、組織碎片等有核細(xì)胞的管中,10010分鐘〔可在擴(kuò)增儀上進(jìn)展〕后12023rpm52、從全血Kd.苯酚：氯仿：異戊醇800μlTE并混勻，12023rpm2C1.0ml上清D1.0mlTE,2分鐘,去除盡可能多的上清液,E、向沉淀中30G、12023rpm5H、留神移出水相〔上層〕到一的1.5ml-20℃下放置10K、傾去酒精，用移液器留神吸去剩余酒精，不要觸動沉淀。M500μl預(yù)冷分析純酒精，用手輕輕混勻，12023rpm10N、用室溫下的70%1mlDNA沉淀,12023rpm5分O、用移液器吸去剩余的酒精，管子置于真空離心抽除剩余的酒精〔10分鐘。或DNA1)a.〔1.21g1.5mlB、加400μl10μlK溶液，混勻，離心D、用一的滅菌牙簽將碎片中的液體擰干后從管中取出。12023rpm3FG、2.5H-20℃10I、1ml70%L、12023rpm5分鐘。N10100℃以下烘干.O、24372C、用一的滅菌牙簽將棉花擰干后從管中取出，再D、移上清液〔內(nèi)含裂解細(xì)胞或“雌性“片段〕1.5ml管，不要振蕩沉淀物〔內(nèi)含非裂解細(xì)胞或精子。再用TNE洗脫沉淀物四次。E、在有沉淀的管中參與DNA5、用Chelex從全血/DNA1〕試100(w/v于無菌水中)2〕A、3μl3mm×3mm1.5ml1mlTEB30C12023rpmE200μl5%Chelex，振蕩30分鐘。GH8I、振蕩數(shù)秒。J12023rpma.TEb.10mg/mlKc.20%Chelex100〔w/v于無菌水中〕d.洗脫緩沖液(10mMTris,10mMEDTA,50mMNaCl,2%SDS,Ph7.5)A1.5ml1mlTE，振蕩數(shù)秒。B30分鐘。CDE12023rpm50μl上清液，勿使“細(xì)胞沉淀“攪起〔假設(shè)沉淀體積較大，應(yīng)保存更多上清液，在此例中，保存的上清液體積應(yīng)為沉淀的2倍G、加150μl2μl蛋白I12023rpm5“精子沉淀“J、20%Chelex，振蕩數(shù)秒后，稍加離心，然后接步驟O～S進(jìn)展操作。K、用0.5ml,用12023rpm5450μlL、重復(fù)步驟KM1ml滅菌的蒸餾去離子5K的二硫蘇糖醇于精子組分1、Q8RS12023rpm3分鐘，兩管的上清中:l反響混合物l〔用前必需用手彈勻，然ddH2O和一滴石蠟油,〔DNA濃度太低,可適當(dāng)增加其體積,但同時(shí)體積,20μl〕稍離心后按以下條件進(jìn)展擴(kuò)增：955分鐘，然后403～60〔每循環(huán)一次降低一度2102℃10分鐘。DNA的提取DNA的提取概述基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交(RFLP),可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部,從而到達(dá)提取的目的。在提取過程中,染色體會發(fā)生氣械斷裂,,DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫存的條件下操作,如盡量削減酚/,DNA。一般來說,構(gòu)建基因組文庫,DNA100kb以上,否則酶RFLPPCR分析DNA50kb,在該長度以上,RFLP片段(20kb以下),PCR所擴(kuò)增的片段(2kb以下)。不同生物〔植物、動物、微生物〕的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞構(gòu)造反響等有較強(qiáng)制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí),應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。 本試驗(yàn)以水(蘋果)葉子動物肌肉組織和大腸桿菌培育物為材料,學(xué)習(xí)基因組DNA提取的一般方法。其次節(jié)從植物組織提取基因組DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李〔蘋果〕幼嫩葉子。 二設(shè)備 移液器冷凍高速離心機(jī)臺式高速離心機(jī)水浴鍋陶瓷研缽離心〔有1.5ml離心管彎成鉤狀的小玻棒。 三試劑 pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。 2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉Pl巰基乙醇加水至l。 3/氯:戊醇:乙醇 4母液配方見第一章。 5其它試劑液氮異丙醇緩沖液無水乙醇乙醇。四操作步驟： 稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取 管中參與20ml提取緩沖液Ⅰ,60℃水浴預(yù)熱。 或葉子5-10g,剪碎,在研缽中加液氮磨成粉狀后馬上倒分鐘(時(shí)間長,DNA產(chǎn)量高),不時(shí)搖動。 3.參與氯仿/戊醇/乙醇溶液,顛倒混勻(需帶手套,防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘,使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重混勻)。 離心5分鐘。 上清液至另一50ml1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即消滅絮狀DNA沉淀。 中鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。 ,則可用5000rpm離心5分鐘,再將沉淀移入TE管中這樣收集的沉分鐘以上，以幫助溶解。.,離心管。.3710分鐘,RNA(RNA。10.1/103mol/LNaAc2×體積的,DNA形成絮狀沉淀。11.DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。.1mlTE-20貯存。13.2μlDNA0.7%,15μl20倍,OD260/OD280,DNA含量及質(zhì)量。500μgDNA,RFLP、PCR等分析之用?！捕?從李(蘋DNA1.3-5克嫩葉,液氮磨成粉狀。2.參與提取緩沖液Ⅱ10ml,再研磨至溶漿狀。10000rpm10min。3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml,混勻。65℃30-60min,常搖動。3-13DNA一、材料哺乳動物鮮組織。二、設(shè)備移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)、水浴鍋。三、試劑1、分別LlLLEDT2、其它試劑：，蛋白酶K或粉劑:氯仿:異戊醇。四、操作步驟:.。2.倒入液氮,磨成粉末,10ml分別緩沖液。3.1ml10%SDS,混勻,此時(shí)樣品變得很粘稠。4.50ul1mgK,371-2小時(shí),直到組織完全解體。5.1ml5mol/LNaCl,混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。6.:氯仿:異戊醇(25:24:1)分鐘。.,2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)狀況。.,保存下層水相。9.1/103mol/LNaAc,2倍體積無水10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。10.用玻棒鉤出DNA1mlTE中,-20℃保存。11.DNA溶液中有不溶短暫離心,取上清;RNA,5μlRNaseA(10μg/μl),3730分,,9-10DNADNA的制備一、材料細(xì)菌培育,高速冷凍離心機(jī),1CTAB/NaCl10gCTAB,100ml。2、其它試劑：氯仿:異戊醇70%乙醇，TE，10SDSK(20mg/ml或粉劑)，10分鐘,去上清液。2.,SDS50μl20mg/ml1mg干粉)K,混勻371小時(shí)。.,混勻。4.1.5mlCTAB/NaCl溶液,混勻6520分鐘。(25:24:1)抽提,5000rpm離心10分鐘,將上清液移至干凈離心管。 6.用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干凈管中。 體積異丙醇,顛倒混合,室溫下靜鐘沉淀DNA。 ,可5000rpm離心,使DNA沉淀。 除去其中的RNA,可以按本章第三節(jié)步驟處理。第五節(jié)基因組DNA的檢測 作Southern,RFLP、所用材料的不同,得到的DNA產(chǎn)量及質(zhì)量均不同,有時(shí)DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會DNA后,DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。1DNA20-30倍后,測定OD260/OD280比值,明確DNA的含量和質(zhì)量。2.取2-5μl在0.7agarose膠上電泳,檢的分子大小。.,單位(U)HindⅢ酶切過夜0.7agarose膠上電泳,檢測。假設(shè),,多,影響接續(xù)的分析和操作,可以用以下方法處理：〔1〕選用幼嫩植物組織，可削減淀粉類的含量。,去除蛋白質(zhì)和多糖?！?〕Sepharose柱過濾,DNA?！?〕CsCl梯度離心,去除雜質(zhì),DNA(可用作文庫構(gòu)建)。DNA的方法1.2500rpm，10min3.1ml細(xì)胞裂3小時(shí).4.1ml平衡酚，混勻，6000rpm，管，加等體積氯仿/異丙醇，混勻，6000rpm，10min7.取上清于混勻，加等體積的異丙醇，混勻，可見白色沉淀，10000rpm，5min8.去上清，9.TEDNADNA濃度。留意事項(xiàng)：要看一下酚的顏色，一般為黃色，假設(shè)變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。酚有強(qiáng)腐蝕性，易引起燒傷，一旦皮膚沾染上，應(yīng)用清水沖洗，用肥皂或稀釋的蘇打水洗滌，切記不用酒精擦洗。溶血試劑，需要高溫高壓消毒。核酸因含有共軛的苯環(huán)而吸取紫外光，DNARNA的最大紫外光吸取mm1時(shí)〔，A×1.8，如RNA1.8會有大的偏差。DNA簡易高效提取方案〔OD6002-3〕2023rpm的速度〕，然后以冷的、等體積的無菌蒸餾水洗滌300μl200μl1：1苯酚：氯仿混和液6-10DNA5min將上層的水相轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中體積〔400μl〕氯虜⒎ 6步離心