（優(yōu)選）離子交換柱層析法分離氨基酸當(dāng)前第1頁\共有19頁\編于星期三\7點一、實驗?zāi)康暮鸵?.學(xué)習(xí)采用離子交換柱層析法分離氨基酸的原理和方法。2.掌握離子交換柱層析法的基本操作技術(shù)，包括樹脂的裝柱加樣、洗脫、檢查等。當(dāng)前第2頁\共有19頁\編于星期三\7點二、實驗原理

離子交換樹脂是具有酸性或堿性的合成聚苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。各種氨基酸分子的結(jié)構(gòu)不同從而導(dǎo)致pI點不同。各種氨基酸在同一pH時帶有不同的電荷，與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可依親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達到分離的效果。當(dāng)前第3頁\共有19頁\編于星期三\7點樹脂對離子的親和力，與水合離子半徑、電荷及離子的極化程度有關(guān)。水合離子半徑愈小、電荷愈高、極化程度愈大，則它的親和力愈大。其中靜電力起主要作用。在ph=5.8的緩沖液中，在陽離子柱中氨基酸洗出的大體順序為酸性、中性、堿性。本試驗所用氨基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸，pI=2.97;Lys(賴氨酸）是堿性氨基酸，pI=9.74。茚三酮跟蛋白質(zhì)或者多肽在加熱條件下發(fā)生紫色反應(yīng)當(dāng)前第4頁\共有19頁\編于星期三\7點三、實驗試劑1、732陽離子交換樹脂2、2mol/L鹽酸溶液。3．2mol/L氫氧化鈉溶液。4.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、賴氨酸均配制成4mg／mL的0.1mol/L鹽酸溶液。5．混合氨基酸溶液：將上述天冬氨酸、賴氨酸各溶液按1:3的比例混合。6.兩種檬酸鈉-氧氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH5.8，鈉離子濃度0.45mol/L的緩沖液和鈉離子濃度為0.90mol/L的緩沖液)取檸檬酸14.25g、氫氫化鈉9.3g和濃鹽酸5.25mL溶于少量蒸餾水后，定容至500Ml（另一種定容至250mL），冰箱保存。7．顯色劑：稱取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇單甲醚中，加蒸餾水至100mL。8．50%乙醇水溶液。當(dāng)前第5頁\共有19頁\編于星期三\7點離子交換樹脂轉(zhuǎn)型示意圖當(dāng)前第6頁\共有19頁\編于星期三\7點離子交換樹脂分離氨基酸原理示意圖當(dāng)前第7頁\共有19頁\編于星期三\7點四、實驗器材MC99-3自動液相色譜分離層析儀層析管（20cmX1cm）專用試管（≥50支）水浴鍋鋁制試管架X2分光光度計玻璃棒移液管洗瓶硅膠管當(dāng)前第8頁\共有19頁\編于星期三\7點五、實驗步驟1、樹脂的準(zhǔn)備：將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型后洗至中性待用。方法如下：將干的強酸型離子交換樹脂用蒸餾水浸過夜或攪拌2小時，使其充分溶脹，傾去細小顆粒，再用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡一小時（樹脂換為氫型），傾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氫氧化鈉溶液做同樣處理（樹脂換為鈉型），洗至中性待用。當(dāng)前第9頁\共有19頁\編于星期三\7點2、連接裝置梯度混合器→恒流泵→層析管→部分收集器當(dāng)前第10頁\共有19頁\編于星期三\7點3、裝柱干凈的燒杯內(nèi)裝入大約20mL樹脂和10mL蒸餾水。將層析管用層析管架固定在鐵架臺上適當(dāng)高度，一個同學(xué)一手手執(zhí)燒杯，一手用玻璃棒快速在杯口攪動樹脂，使樹脂緩慢均勻的流入層析管。另一個同學(xué)控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度注意：1、裝柱過程不可中斷，倒樹脂要緩慢均勻2、剛開始倒樹脂時，水流出速度要控制到很小，同時可以適當(dāng)多加點水。最后一段加水和放水都要慢，裝柱過程中水面一定不能低于樹脂，但也不能溢出。當(dāng)前第11頁\共有19頁\編于星期三\7點倒好的層析管端面平整，無氣泡，約18cm高當(dāng)前第12頁\共有19頁\編于星期三\7點4．平衡：將層析管與恒流泵聯(lián)接，從燒杯中吸取pH=5.8鈉離子強度為0.45的檸檬酸緩沖液平衡層析柱，流出液達床體積的四倍以上時，用pH試紙測流出的液體的pH，直到和緩沖液的pH一樣時（即試管內(nèi)的pH和緩沖液一樣）即可上樣。在平衡同時進行調(diào)速：調(diào)節(jié)恒流泵流速，定時收集流出液并測量流出液的體積，根據(jù)流出液體積與所需時間計算其流速，反復(fù)調(diào)整測量直到流速約為1mL/min。當(dāng)前第13頁\共有19頁\編于星期三\7點5．加樣:平衡好后，停止加入緩沖溶液，待緩沖溶液彎月面靠近樹脂頂端時，關(guān)閉下端開口。加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待樣品彎月面靠近樹脂頂端時，立即用少量濃度為（0.45mol/L）的檸檬酸緩沖溶液沖洗層析管內(nèi)壁數(shù)次，再加入緩沖液約3～4厘米左右。加樣時應(yīng)避免沖破樹脂表面，且避免將樣品全部加在某一局限部位。注意：平衡、加樣、洗脫時都不能沖破樹脂表面當(dāng)前第14頁\共有19頁\編于星期三\7點加樣示意圖當(dāng)前第15頁\共有19頁\編于星期三\7點6.洗脫并收集:

將體積均70mL（建議適量多加）離子強度為0.45與0.9的兩種緩沖溶液分別加入到梯度混合器的兩個燒杯中。其中0.45的加入到直接輸出溶液的那個池，如圖將層析管與恒流泵，恒流泵與梯度混合器聯(lián)接。同時開始用部分收集器開始收集洗脫液，1.5ml/管×50。注意：設(shè)置首管為1，若有50支管，建議末管號設(shè)置為51當(dāng)前第16頁\共有19頁\編于星期三\7點7．氨基酸的鑒定：向各管收集液中加1.5mL水合茚三酮顯色劑并混勻（加顯色劑規(guī)則為：前10管都加，以后每隔一管加一次，但當(dāng)出現(xiàn)顯色時，周圍幾管都加。）在沸水浴中準(zhǔn)確加熱15min后冷卻至室溫，再在加過顯色劑的試管中加1.5mL的50%乙醇溶液，放置10min。以收集液第二管為空白，對加過顯色劑和乙醇的試管進行光波吸收測定（測定570nm波長的光吸收值）。以光吸收值為縱坐標(biāo)，以洗脫體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線當(dāng)前第17頁\共有19頁\編于星期三\7點注意：1.試管太多，建議大家進行水浴時使用鋁制試管架或100mL燒杯水浴，使用橡皮筋綁試管時一捆不要太多，否則中間的管容易脫出摔裂。水浴鍋內(nèi)水面剛好沒過試管架中層即可。水浴完成后用鑷子和抹布把試管架拿出來。2.應(yīng)避免用手直接接觸茚三酮。當(dāng)前第18頁\共有19頁\編于星期三\7點六、思考題1、為什么要使樣品緩慢的進入層析柱的樹脂？2、為什么要使用梯