禽流感細胞滅活苗的研究及亞型禽流感病毒感染豬的血清學調查演示文稿當前第1頁\共有31頁\編于星期四\20點（優(yōu)選）禽流感細胞滅活苗的研究及亞型禽流感病毒感染豬的血清學調查當前第2頁\共有31頁\編于星期四\20點1.1禽流感疫苗的研究進展全病毒滅活疫苗

基因工程亞單位疫苗

重組活載體疫苗

核酸疫苗

流感減毒活疫苗

禽流感疫苗冷適應減毒活疫苗

重配減毒活疫苗基因工程減毒活疫苗

復制缺陷型流感減毒活疫苗表位疫苗

通用疫苗當前第3頁\共有31頁\編于星期四\20點1.2禽流感檢測方法的研究進展

病毒的分離鑒定

瓊脂凝膠擴散試驗（AGP）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）

神經氨酸酶抑制試驗（NIT）病毒中和試驗（NT）

免疫熒光技術（IFT）

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

分子生物學診斷技術

禽流感的檢測方法當前第4頁\共有31頁\編于星期四\20點二、禽流感細胞滅活疫苗的研究當前第5頁\共有31頁\編于星期四\20點滅活疫苗安全性好，免疫原性強，給免疫雞群提供良好的免疫保護。目前已得到廣泛的應用。細胞苗與傳統(tǒng)的雞胚苗相比，抗原性更接近自然流行株，可減少宿主蛋白成分，減少變態(tài)反應，避免雞胚傳代后引起抗原性變異。本試驗將禽流感病毒H5N1接種MDCK細胞，通過收獲細胞病變液經滅活制成細胞滅活疫苗，為HPAI的防控提供新的疫苗儲備。

2.1研究的目的和意義當前第6頁\共有31頁\編于星期四\20點敏感細胞株的篩選

高效價病毒毒株的篩選

病毒增殖滴度的研究

禽流感細胞苗的制備

病毒滅活效果檢驗疫苗物理性狀檢驗疫苗的無菌檢驗疫苗安全性試驗免疫保護力試驗抗體消長規(guī)律試驗疫苗保存期試驗技術路線當前第7頁\共有31頁\編于星期四\20點2.2試驗方法、結果與分析敏感細胞株的篩選

代次細胞F1F2F3F4F5CEF2626252625MDCK2928282729Vero2525262422BHK-21232324240“2n”表示血凝價為nlog2

表2-1禽流感病毒在4種細胞上的血凝價當前第8頁\共有31頁\編于星期四\20點結果表明，病毒在MDCK細胞上增殖的血凝價最高，達到27以上，且比較穩(wěn)定。病毒在CEF、Vero和BHK細胞上的增殖滴度都比較低在26以下，也不適于選用。因此我們選用MDCK細胞用于細胞苗制備的細胞系。當前第9頁\共有31頁\編于星期四\20點禽流感病毒接種MDCK細胞后20～36h開始出現(xiàn)呈現(xiàn)明顯的細胞病變正常的MDCK細胞排列整齊，界限清晰病變的細胞變圓，脫落、顆粒增多，成片細胞之間有絲相連，成“拉網(wǎng)”結構。圖2-1正常MDCK細胞與細胞病變

當前第10頁\共有31頁\編于星期四\20點穩(wěn)定、高效價病毒毒株的篩選F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10XSHA262625252625242300TCID5010-6.010-6.110-5.810-5.510-4.810-5.210-4.010-3.100JXHA2525242425242323220TCID5010-5.210-5.010-4.510-4.010-4.010-4.210-4.210-3.000XFYHA26252524242425232423TCID5010-4.310-4.010-4.010-3.510-4.510-3.010-4.010-4.010-3.510-3.5DWHA292828272728282928210TCID5010-7.010-7.110-7.510-7.510-7.010-7.210-7.110-7.510-7.110-7.5表2-24個AIV毒株在MDCK上傳10代后的血凝HA效價和TCID50（TCID50/0.1mL）當前第11頁\共有31頁\編于星期四\20點毒株XS、JX和XFY的血凝價和TCID50較低且不穩(wěn)定，隨著連續(xù)傳代呈下降趨勢。DW毒株的血凝價最高達210，TCID50≧10-7.0/0.1mL。因此我們確定DW毒株為制苗用毒株。A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1)當前第12頁\共有31頁\編于星期四\20點病毒增殖滴度的研究

AIV代次F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10血凝價28282727262828282829TCID5010-6.810-6.810-7.010-7.110-7.510-7.210-7.510-7.310-7.310-7.8AIV代次F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20血凝價28292122122102928282929TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.810-7.510-7.510-7.810-7.710-7.610-7.7AIV代次F21F22F23F24F25F26F27F28F29F30血凝價210292921029282112921029TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.610-7.910-7.810-7.810-7.410-7.810-7.5表2-3不同代次禽流感病毒在MDCK細胞上的血凝價和TCID50（TCID50/0.1mL）當前第13頁\共有31頁\編于星期四\20點結果表明H5N1毒株經MDCK細胞接種培養(yǎng)30代后，血凝價穩(wěn)定在28以上，TCID50穩(wěn)定在10-7.0/0.1mL以上。隨著代次的增加，血凝價和TCID50都逐漸上升且穩(wěn)定，為疫苗的制備提供了高免疫原性的抗原。當前第14頁\共有31頁\編于星期四\20點病毒的滅活及滅活效果檢驗滅活：以終濃度為0.4％的甲醛溶液滅活。滅活檢驗：將滅活的病毒液接種9～10日齡雞胚，盲傳3代后，全部雞胚發(fā)育正常。說明病毒滅活徹底，保證了疫苗的生物安全。當前第15頁\共有31頁\編于星期四\20點疫苗的安全性試驗安全性試驗：用制備的細胞滅活苗雙倍劑量接種28日齡H5-AIV抗體陰性雞10只，0.4mL/只，雞群未出現(xiàn)異常反應和局部損傷。說明所制備的細胞苗安全性良好。當前第16頁\共有31頁\編于星期四\20點疫苗的免疫保護力試驗組別免疫劑量攻毒時間攻毒劑量免疫保護力健活數(shù)死亡數(shù)H5細胞滅活苗0.2mL免疫后21天0.2mL8/80/8H5尿囊液毒滅活苗8/80/8禽流感滅活苗（N28株，哈獸研）8/80/8空白對照（無菌DMEM培養(yǎng)基）0/88/8將疫苗免疫H5抗體陰性雞21d測得HI抗體水平達到29，用100LD50的H5N1-AIV進行攻毒。表2-4各免疫組攻毒保護試驗

當前第17頁\共有31頁\編于星期四\20點結果表明，各免疫組雞全部健活，保護率為100%?？瞻讓φ战M雞攻毒后24h開始出現(xiàn)精神萎靡、流淚、呼吸困難、顏面水腫、羽毛松散等癥狀，并出現(xiàn)死亡，在5天內全部死亡。說明研制的H5亞型禽流感病毒細胞滅活苗免疫效果良好，與尿囊液滅活苗和禽流感滅活苗（N28株，哈獸研）的免疫保護率相當，可以對同亞型的病毒攻擊起到保護作用。當前第18頁\共有31頁\編于星期四\20點抗體消長規(guī)律試驗

疫苗免疫后7天開始檢測到抗體，至第3周抗體水平上升較快，HI效價均達到29以上。從第3周至第7周，抗體水平持續(xù)緩慢地上升至29～211。到第8周抗體水平開始緩慢下降，至36周細胞苗組的抗體在25左右?？瞻讓φ战M雞的抗體一直在24以下，禽流感抗體陰性。說明制備的細胞苗免疫效果可以維持9個月以上。HI效價(log2)免疫后時間（周）

當前第19頁\共有31頁\編于星期四\20點保存期試驗

存放時間HI抗體7d14d21d28d35d60d6個月25.226.029.8210.129.829.210個月25.026.229.5210.029.829.0對照組000000疫苗保存10個月后免疫雞，28d高峰可達210.0。因此該疫苗保存期暫定10個月（4-8℃）。

將疫苗置于4℃保存6、10個月后均未出現(xiàn)分層破乳現(xiàn)象。疫苗免疫雞后，無不良反應。

表2-5保存期試驗結果免疫抗體水平

當前第20頁\共有31頁\編于星期四\20點2.3小結本試驗篩選了MDCK細胞和DW毒株A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1)為本試驗制苗用細胞系和毒株。研制了H5亞型禽流感細胞滅活苗，并對其免疫效果進行了評價，該疫苗對同亞型病毒的攻擊能提供100%保護。抗體持續(xù)時間達到9個月，4℃保存期為10個月。當前第21頁\共有31頁\編于星期四\20點三、H9亞型禽流感感染豬的血清學調查當前第22頁\共有31頁\編于星期四\20點3.1研究的目的和意義禽流感已突破種屬障礙感染人并致人死亡。H9N2在豬中也分離到，且能直接感染人。豬是禽流感病毒和其他流感病毒的混合器，在禽－豬－人的種間傳播中起到非常重要的作用。做好對豬群的監(jiān)測，建立一套早期預警體系，即可提前預報流感大流行。本實驗利用建立的H9HA-ELISA診斷方法，對來自湖北、湖南和安徽三省的949份豬血清進行了血清學分析。當前第23頁\共有31頁\編于星期四\20點技術路線抗原的制備抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定陰陽性界線的確定分析特異性試驗重復性試驗符合率試驗診斷特異性試驗診斷敏感性試驗ELISA診斷方法的建立豬的血清學檢測當前第24頁\共有31頁\編于星期四\20點

H9-HA蛋白SDS結果

圖3-1原核表達載體pKG-H9HAM誘導表達產物的SDS檢測1:pKG-H9HAM;2:pGEX-KG結果顯示：含pKG-H9HAM重組質粒的E.coliBL21在約90KDa處有明顯的表達帶，H9HA蛋白約63KDa，與GST融合后約為90KDa。而含pGEX-KG的E.coliBL21的對照在約26KDa有明顯的表達帶，相當于GST蛋白的分子量。說明目的基因獲得了表達。

3.2試驗方法、結果與分析當前第25頁\共有31頁\編于星期四\20點ELISA抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定AgDilutionSerumDilutionABCDEFGH1:101:201:401:801:1601:3201:6401:1280+11：102.0111.8021.7961.6131.5641.5321.2011.01821：201.9211.7191.6161.5991.5541.5191.0780.93531：401.8221.6831.6591.5161.5141.4580.9760.84541：801.8101.6171.6511.4631.4461.1730.6700.45151：1601.5981.5081.5571.1271.0310.6530.4130.35561：3201.4271.3421.4161.0160.7730.4620.4180.311_71：100.5010.4540.3520.2620.2530.1780.1760.13581：200.4840.4670.2490.2350.2060.1390.1080.09891：400.4450.4460.2590.2080.1840.0670.0590.045101：800.4180.4080.2150.1510.1240.0780.0550.057111：1600.3650.3540.1260.0920.0630.0290.0410.045121：3200.2470.2760.1030.0530.0400.0180.0210.021表3-1ELISA方陣滴定結果

當前第26頁\共有31頁\編于星期四\20點ELISA陰陽界限的確定

將臨床送檢經HI檢測為陰性的100份豬血清，進行ELISA檢測均為陰性，計算該100份血清的OD630nm平均值X=0.143，標準差SD=0.087，因而根據(jù)公式X+3SD求得陰陽界限為0.404。結果判定：以空白孔調零，在酶標儀上測各孔OD630nm值OD630nm≥0.404判為陽性；OD630nm＜0.404判為陰性。當前第27頁\共有31頁\編于星期四\20點重復性試驗批內重復的吸收變異系數(shù)C.V在4.9％-8.4％之間；批間重復的吸收變異系數(shù)C.V在5.3％-9.5％之間。說明該診斷方法具有良好的重復性。當前第28頁\共有31頁\編于星期四\20點分析特異性試驗

血清陽性血清血清樣品12345678910OD6300.1020.1230.0980.1040.0890.1010.1110.0791.3050.1031)弓形蟲；2)豬瘟；3)胸膜肺炎；4)口蹄疫病毒；5)偽狂犬病毒；6)細小病毒；7)乙腦病毒；8)豬繁殖與呼吸道綜合癥；9)豬抗H9-AIV陽性血清；10)陰性血清上述結果表明該ELISA方法檢測弓形蟲、豬瘟等8種豬病陽性血清均無交叉反應，檢測H9-AIV豬陽性血清結果為陽性，陰性血清結果為陰性，表明該方法的分析特異性良好。表3-4分析特異性試驗結果當前第29頁\共有31頁\編于星期四\20點診斷特異性、敏感性與符合率試驗

血凝抑制試驗（HI）合