生物大分子識(shí)別分離和檢測第一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三生物大分子生物大分子:指分子量大于10,000，有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)，具有生物活性的物質(zhì)；如多肽、蛋白質(zhì)、酶等。特性：具有特定的生化結(jié)構(gòu)（組成，序列和構(gòu)象）分子量大，分子極性強(qiáng)對溫度、pH值、剪切力、有機(jī)溶劑等非常敏感第二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三生物大分子的識(shí)別“看清”生物大分子“是誰”；“看清”生物大分子“是什么樣子”。第三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

質(zhì)譜測定分析——

一種識(shí)別生物大分子的方法

質(zhì)譜測定分析法是通過測定樣品中物質(zhì)的質(zhì)量來識(shí)別物質(zhì)的類別。傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析方法是：首先將成團(tuán)的蛋白質(zhì)分子拆分成各自獨(dú)立的單個(gè)分子，將其電離并使之懸浮在真空中，然后讓它們在電場作用下運(yùn)動(dòng)。這種方法的缺點(diǎn)在于生物大分子比較脆弱，在拆分和電離成團(tuán)的生物大分子過程中它們的結(jié)構(gòu)和成分很容易被破壞。第四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三美國科學(xué)家約翰?芬恩，獲2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)日本科學(xué)家田中耕一，獲2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)對成團(tuán)的生物大分子施加強(qiáng)電場用軟激光轟擊成團(tuán)的生物大分子使生物大分子相互完整地分離，同時(shí)也被電離。第五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三芬恩的電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（ESI）原理圖田中耕一的軟激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（RLD）原理圖質(zhì)譜測定方法解決了“看清”生物大分子“是誰”的問題第六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三電噴霧質(zhì)譜法

electronspraymassspectrometryESMS

樣品溶液經(jīng)很細(xì)的進(jìn)樣管進(jìn)入電噴霧室，在強(qiáng)電場的作用下，樣品溶液在出口處因電荷的分離和靜電引力而破碎成許多細(xì)小的帶有電荷的液滴，當(dāng)液滴蒸發(fā)到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊的質(zhì)子化和去質(zhì)子化的蛋白分子。

第七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三電噴霧液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀第八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

樣品的分子離子和裂片離子經(jīng)一系列分離器和靜電透鏡進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行質(zhì)譜分析。這種電噴霧質(zhì)譜法具有很高靈敏度，且電離的分子可以帶有多電荷，這種多電荷離子的產(chǎn)生大大擴(kuò)展了普通質(zhì)譜儀能分析的質(zhì)量范圍，使質(zhì)譜儀可以分析分子量為幾十萬質(zhì)量單位的蛋白質(zhì)分子。精確度達(dá)到99.99%。第九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

MatrixAssistedLaserDesorptionIonizationTimeof

FlightMassSpectrometry（MALDI-TOFMS）

MALDI-TOFMS的原理是：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而被檢測，即測定離子的質(zhì)量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比來檢測離子。MALDI-TOF-MS的中心技術(shù)就是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（m/z）的不同來進(jìn)行檢測，并測得樣品分子的分子量。

第十頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

MALDI-TOFMS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高、圖譜簡明、質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在操作上制樣簡便、可微量化、大規(guī)模、并行化和高度自動(dòng)化處理待檢生物樣品，而且在測定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性。近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力工具。

激光解吸附電離質(zhì)譜儀第十一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

在核磁共振技術(shù)出現(xiàn)以前，X射線晶體分析技術(shù)是惟一可以研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法。該法是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶對X射線的衍射作用實(shí)現(xiàn)的。但該法不能對溶液進(jìn)行分析。

核磁共振技術(shù)彌補(bǔ)了X射線晶體分析技術(shù)的不足，能夠?qū)θ芤褐械牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行分析，即在蛋白質(zhì)最自然的生存環(huán)境下對它們進(jìn)行研究，進(jìn)而得到“活”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。核磁共振——

一種揭示生物大分子真面目的方法第十二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

在結(jié)晶狀態(tài)下蛋白質(zhì)分子是緊緊地積壓在一起的，而在溶液中它們則處在最自然的生理狀態(tài)下。

朊病毒蛋白質(zhì)分子中肽鏈有一半（23-120）在水溶液中是呈現(xiàn)無規(guī)則的、松散的、靈活多變的狀態(tài)。應(yīng)用核磁共振技術(shù)測定的朊病毒蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)圖

核磁共振法獨(dú)到之處是測定溶液中的蛋白質(zhì)，是在最接近分子自然生理狀態(tài)的條件下進(jìn)行測定。第十三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

維特里希設(shè)計(jì)了一套將核磁共振信號(hào)與生物大分子中的質(zhì)子相對應(yīng)的系統(tǒng)分析方法。他進(jìn)一步說明這些質(zhì)子間的距離如何確定，再結(jié)合距離幾何學(xué)的數(shù)學(xué)方法就可獲得大分子清晰的三維結(jié)構(gòu)圖。

瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼?維特里希，獲2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第十四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

如果確定了一座建筑物的所有工程數(shù)據(jù)，就可以快速而準(zhǔn)確地繪出該建筑物的三維結(jié)構(gòu)圖。

核磁共振技術(shù)方法解決了“看清”生物大分子“是什么樣子”的問題。第十五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三生物大分子的分離與檢測

生物大分子通常來自天然產(chǎn)物或發(fā)酵液中，并以混合物、低濃度的狀態(tài)存在。 除了分子量大，還具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜（具三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)），具有生物活性，一旦條件不適合就喪失活性，因此在分離技術(shù)上與一般的小分子有機(jī)物的分離有差別。質(zhì)譜色譜第十六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三色譜法

由液相色譜、氣相色譜和毛細(xì)管電泳等所組成的色譜學(xué)是現(xiàn)代分離、分析的主要組成部分。液相色譜與毛細(xì)管電泳技術(shù)是目前已知的兩種最有效的分離生物大分子的方法。毛細(xì)管電泳處理量小，在分離過程中會(huì)破壞生物大分子的構(gòu)象、降低其生物活性。液相色譜一般在室溫下進(jìn)行，所用流動(dòng)相為液體，固定相的表面經(jīng)過各種化學(xué)修飾，能為生物大分子的分離提供“軟接觸”的溫和相互作用，因此成為分離生物大分子強(qiáng)有力的手段。第十七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三膜色譜技術(shù)

膜色譜技術(shù)是液相色譜與膜分離相結(jié)合的一種新技術(shù)，融合了二者之長，具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點(diǎn)，能滿足生物大分子高效分離與純化的需要。膜色譜采用具有一定孔徑的膜作為介質(zhì),連接配基,利用膜配基與生物大分子之間的相互作用進(jìn)行分離純化。當(dāng)料液以一定流速流過膜的時(shí)，目標(biāo)分子與膜介質(zhì)表面或膜孔內(nèi)基團(tuán)特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則透過膜孔流出，待處理結(jié)束后再通過洗脫液將目標(biāo)分子洗脫下來，其純化倍數(shù)可達(dá)數(shù)百乃至上千倍。第十八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三膜色譜特點(diǎn)為:優(yōu)點(diǎn)：(1)生物大分子在膜介質(zhì)中以對流傳質(zhì)為主，分離速度快，特別適用于生物大分子的快速分離(2)柱壓低(3)易于放大，只要簡單的增加柱長就可以達(dá)到目標(biāo)(4)可直接處理復(fù)雜的生物樣品，幾乎不需要與處理(5)膜基質(zhì)生物兼容性好缺點(diǎn)：(1)柱效低(2)耐壓性差第十九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三現(xiàn)代分離制備技術(shù)課程論文備選題1.物質(zhì)分離技術(shù)論述2.天然產(chǎn)物的分離提取原理及