產(chǎn)漆酶菌株的篩選與酶活性的測(cè)定

目錄TOC\o"1-3"\h\u20304摘要 前言漆酶是一種結(jié)合多個(gè)銅離子的多酚氧化酶，其肽鏈一般由500個(gè)左右氨基酸組成，糖配基占整個(gè)分子的10%-45%，是一種結(jié)合多個(gè)銅離子的糖蛋白，是銅藍(lán)氧化酶蛋白家族的一員漆酶是一種綠色的生物催化劑[12-15]。漆酶廣泛存在于自然界的許多物種中，包括動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)菌。漆酶，具有廣泛的底物。它不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質(zhì)素，去除許多有毒酚類(lèi)物質(zhì)的毒性，還可以使多種染料及其廢水脫色。因此在食品、造紙、環(huán)保、生物檢測(cè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域具有較大的研究和應(yīng)用價(jià)值[1,2]。其作用主要表現(xiàn)在：參與有機(jī)物合成、生物檢測(cè)、紙漿生物漂白、工業(yè)廢水處理、有毒化合物的清除等。由于漆酶很大的應(yīng)用價(jià)值，進(jìn)行產(chǎn)漆酶菌的分離篩選也一直是研究的熱點(diǎn)之一。從目前的報(bào)道顯示，漆酶最主要來(lái)源于子囊菌、擔(dān)子菌亞門(mén)的高等真菌，尤其是擔(dān)子菌的白腐真菌[3]，目前報(bào)道來(lái)看這些菌株是最有效的芳香族類(lèi)化合物的降解菌。但是白腐菌一般生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，其所產(chǎn)漆酶大多是誘導(dǎo)酶[4]，這些特征使工業(yè)生產(chǎn)漆酶難以有效進(jìn)行，因此篩選生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)漆酶時(shí)間早的菌株具有非常重要的意義。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究，目前已經(jīng)獲得了許多產(chǎn)漆酶的細(xì)菌和霉菌，比如膨大擬青霉菌[5]，就具有一定降解木質(zhì)素能力。有關(guān)枯草桿菌與球菌分泌漆酶也有少量報(bào)道，但是它們漆酶活性都比較低。目前有關(guān)漆酶的最普遍的來(lái)源是真菌，已知在許多種真菌菌株的分泌物中檢測(cè)到了漆酶的活性[6]。本實(shí)驗(yàn)是從土壤中篩選能夠產(chǎn)生漆酶的菌株，選用簡(jiǎn)便有效地篩選方法，更快的篩選具有產(chǎn)漆酶能力的高產(chǎn)菌株。從有關(guān)漆酶的報(bào)道來(lái)看，我們可以知道對(duì)產(chǎn)漆酶菌株的研究是非常有意義的，因此我選擇了這個(gè)課題實(shí)驗(yàn)。我們從南昌農(nóng)藥廠采集不同的土壤進(jìn)行研究，從土壤中篩選出能夠產(chǎn)漆酶的菌株，并對(duì)高產(chǎn)漆酶的菌株進(jìn)行鑒定。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料與方法根據(jù)土樣采集標(biāo)準(zhǔn)方法[7]，本實(shí)驗(yàn)以從南昌農(nóng)藥廠采集來(lái)的土壤樣品各5g為材料，在無(wú)菌操作下，通過(guò)初篩和復(fù)篩，挑取篩選平板上菌落規(guī)則、顏色明顯并具漆酶酶活性質(zhì)的單菌落，用ABTS分光光度計(jì)法在420nm的波長(zhǎng)下漆酶酶活，選出產(chǎn)漆酶最高的菌株。將此菌株用20%的甘油保藏備用。之后將此產(chǎn)漆酶酶最高的菌株進(jìn)行活化后并用CTAB法提取待測(cè)菌株全基因組做菌種鑒定。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及主要試劑：LDZX—50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠PHS-3C型雷磁PH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司LRH-250A型生化培養(yǎng)箱韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司SW—CJ—2G型雙人凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司UU765型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司JW—3022HR型高速冷凍離心機(jī)安徽嘉文儀器裝備有限公司101—2型干燥箱上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠SPY50型雙層培養(yǎng)搖床上海市離心機(jī)械研究所愈創(chuàng)木酚：2-甲氧基酚ABTS：2,2’-連氮基-雙（3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸）HAC-NaAc(pH4.5)緩沖液TE緩沖液：稱(chēng)Tris-cl15.764g，EDTA0.2922g，加蒸餾水調(diào)pH至8.0，再定容至1000ml，高溫滅菌即可。裂解緩沖液：稱(chēng)Tris-cl15.764g，EDTA0.2922g，加蒸餾水調(diào)pH至8.0，再加蔗糖119.801g，最后定容至1000ml，高溫滅菌即可。CTAB緩沖液：稱(chēng)Tris-cl15.764g，EDTA0.2922g，CTAB20g,NaCl87.66g,加蒸餾水溶解調(diào)pH至8.0，最后定容至1000ml，高溫滅菌即可。TBE(5×）：稱(chēng)Tris54g，硼酸27.5g，EDTA0.29225g，加蒸餾水溶解調(diào)pH,8.0后定容至1000ml，即可。3mol/ml的醋酸鈉緩沖液：無(wú)水醋酸鈉24.61g，超純水100ml，冰乙酸調(diào)pH5.2后，4℃保存?zhèn)溆谩?.2培養(yǎng)基1.2.1PDA篩選培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，愈創(chuàng)木酚(或a-萘酚）0.4ml/L，pH自然，120℃滅菌20min。1.2.2種子培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，120℃滅菌20min。1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，酒石酸銨10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，無(wú)水氯化鈣0.075g/L，五水硫酸銅0.01g/L，pH自然，120℃滅菌20min。1.2.4菌種保藏斜面培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然，120℃滅菌20min。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1產(chǎn)漆酶菌株的篩選平板初篩將從南昌農(nóng)藥廠采取的土壤樣品分別稱(chēng)量5g梯度稀釋到10-7涂布到PDA篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（梯度稀釋到10-3菌株才會(huì)再生長(zhǎng)）。取1ml土壤稀釋液均勻涂布在含有愈創(chuàng)木酚(或a-萘酚）的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7天，或者直接挑取少量土壤接種于含有愈創(chuàng)木酚(或a-萘酚）的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7天。待菌株生長(zhǎng)出后，挑取周邊有紅色（紫色）變色圈（菌株分泌的胞外漆酶能使以愈創(chuàng)木酚為底物進(jìn)行氧化，形成鮮艷、均勻的紅色氧化帶,并且菌株顏色深淺、帶寬能較好地反應(yīng)漆酶活性）的菌落劃線分離。將分離后的能產(chǎn)生變色圈的菌株重新接種至新的平板，對(duì)菌株進(jìn)行了重復(fù)篩選，通過(guò)劃線分離4次篩選出單菌落，根據(jù)菌落顏色的深淺和變色圈的大小可以初步篩選出產(chǎn)漆酶活力較高的菌株。搖瓶復(fù)篩在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，進(jìn)行接種。用接種環(huán)從長(zhǎng)滿菌絲的平板上挑取少量菌絲接入種子培養(yǎng)基（50ml/250ml），28℃、200r/min搖床恒溫培養(yǎng)48h，取菌懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml），接種量為3ml/瓶，28℃、200r/min搖床恒溫培養(yǎng)7d。1.3.2漆酶液態(tài)發(fā)酵及其制備將初步篩選的菌株用接種環(huán)從長(zhǎng)滿菌落的平板中挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落接入種子培養(yǎng)基（50ml/250ml），28℃、200rpm搖床恒溫培養(yǎng)48h，取菌懸液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml），接種量為3ml/瓶，28℃、200pm搖床恒溫培養(yǎng)7d。在發(fā)酵的過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行漆酶活性的測(cè)定，取出其發(fā)酵液，4℃、10000rpm離心3min，留取上清液，即為粗酶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?漆酶酶活性的測(cè)定2.1ABTS-分光光度計(jì)法以ABTS為底物測(cè)定漆酶酶活是目前國(guó)外最為常見(jiàn)的方法之一[8.9]。它有如下優(yōu)點(diǎn)：ABTS易溶于水，在室溫下放置6個(gè)月仍比較穩(wěn)定。在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩爾吸光系數(shù)比較高，說(shuō)明以其為底物測(cè)定的靈敏度也較高。其反應(yīng)只有一步，ABTS的陽(yáng)離子自由基比較穩(wěn)定，通常在幾個(gè)小時(shí)或者幾天內(nèi)是穩(wěn)定的，并且它在水溶液中為淺藍(lán)色。迄今為止，還沒(méi)有報(bào)道稱(chēng)ABTS有誘變作用、致癌作用，或者有強(qiáng)烈的毒性。一般以ABTS作為底物，采用乙酸-乙酸鈉緩沖體系、檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖體系或者Glycine-Hcl緩沖體系。倘若菌株產(chǎn)生過(guò)氧化氫，為了保證測(cè)定準(zhǔn)確性，需要破壞過(guò)氧化氫，應(yīng)加入一定量的過(guò)氧化氫酶。因?yàn)榫暝谏L(zhǎng)代謝過(guò)程中，自身會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫激發(fā)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶對(duì)ABTS的氧化。2.2分光光度法具體步驟取酶液0.1ml，加入HAc-NaAc（pH4.5）緩沖液2.5ml，混勻，加入ABTS0.4ml，放置30s，每15s讀取一次420nm下的吸光值。共讀取6-7個(gè)數(shù)值。以往實(shí)驗(yàn)判斷，如果吸光值增長(zhǎng)迅速，需要將酶液稀釋2-5倍再次測(cè)定，直至吸光值數(shù)值變化不是太快，且數(shù)值均控制在0.2-0.8之間。2.3酶活性的計(jì)算酶活=吸光度變化的斜率×4000×稀釋倍數(shù)酶活單位：漆酶活單位定義為1國(guó)際單位（1U）等于每分鐘氧化1umol底物或生成1umol產(chǎn)物的酶量。3菌株的活化3.1培養(yǎng)基及主要試劑的配置MRS培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，酵母膏5.0g，無(wú)水乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，檸檬酸銨2.0g，吐溫-801.0ml，硫酸鎂帶7個(gè)結(jié)晶水0.50g，硫酸錳帶2個(gè)結(jié)晶水0.25g，至pH7.0；TE緩沖液：稱(chēng)Tris-cl15.764g，EDTA0.2922g，加蒸餾水調(diào)pH至8.0，再定容至1000ml，高溫滅菌即可。（3）裂解緩沖液：稱(chēng)Tris-cl15.764g，EDTA0.2922g，加蒸餾水調(diào)pH至8.0，再加蔗糖119.801g，最后定容至1000ml，高溫滅菌即可。（4）CTAB緩沖液：稱(chēng)Tris-cl15.764g，EDTA0.2922g，CTAB20g,NaCl87.66g,加蒸餾水溶解調(diào)pH至8.0，最后定容至1000ml，高溫滅菌即可。（5）TBE(5×）：稱(chēng)Tris54g，硼酸27.5g，EDTA0.29225g，加蒸餾水溶解調(diào)pH,8.0后定容至1000ml，即可。（6）3mol/ml的醋酸鈉緩沖液：無(wú)水醋酸鈉24.61g，冰乙酸調(diào)pH5.2后，超純水100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?.2菌種活化步驟將產(chǎn)漆酶高的系列1保藏菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)一天，活化二次，此活化的菌株再照改良CTAB法提取全基因組。4改良CTAB法提取待測(cè)菌株全基因組[10.11]4.1基因組提取用移液槍吸取生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)后期的菌懸液至1.5ml離心管中，12000r/min離心3min收集菌體，用50℃的TE緩沖液洗滌菌體4-5次至離心管后上清液澄清。加入200ul裂解液（含10mg/ml溶菌酶），15U變?nèi)芫?，用移液槍反?fù)吹打，使菌體均勻懸浮，37℃保溫3h，期間每隔30min搖勻一次。加入400ulCTAB緩沖液，40ul10mg/ml的蛋白酶K，50℃保溫3h，期間每隔30min搖勻一次。加入100ul10%SDS，室溫10℃12000r/min離心10min，定量取上清液。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），上下顛倒混勻，常溫10000r/min離心5min，定量吸取上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新離心管。重復(fù)上述步驟。加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），上下顛倒混勻，常溫10000r/min離心5min，定量吸取上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新離心管。加入十分之一倍的體積的預(yù)冷醋酸鈉緩沖液和二倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，4℃12000r/min離心5min，沉淀用預(yù)冷70%的乙醇洗二次，再用預(yù)冷無(wú)水乙醇洗一次，干燥后溶于20ul超純水中。加入2ul1mg/ml的RNase，37℃保溫3h，DNA的完整性及濃度用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后分裝于1.5mlEp管，-40℃保存?zhèn)溆?。用改良CTAB法提取待測(cè)菌株全基因組后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外照射下可以看到DNA電泳圖譜，檢測(cè)提取的DNA樣品，將提取的DNA用0.1×TE20ul保存?zhèn)溆谩?結(jié)果與分析a.菌株生長(zhǎng)情況菌落為同心圓向外放射狀，顏色為白色。菌絲致密、短絨、并且緊貼培養(yǎng)基。菌落在7d之后逐漸變?yōu)椴煌该鞯母煞蹱?。如圖1為在加愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基平板上的正反面照片。該類(lèi)菌株分泌的胞外漆酶能夠使愈創(chuàng)木酚變?yōu)殍F紅色。經(jīng)過(guò)篩選培養(yǎng)基篩選得到產(chǎn)漆酶的菌株形態(tài)如下：圖1菌株在含有愈創(chuàng)木酚的PDA平板上的菌落情況b.菌株發(fā)酵情況在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要優(yōu)化漆酶合成的發(fā)酵條件，才能提高發(fā)酵液中漆酶的產(chǎn)量，其中影響產(chǎn)酶的主要因素有初始pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速、和接種量，碳源、氮源以及溫度等。本實(shí)驗(yàn)適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖2%，酒石酸銨1%，磷酸二氫鉀0.2%，七水硫酸鎂0.05%，無(wú)水氯化鈣0.0075%，五水硫酸銅0.001%。適宜的培養(yǎng)條件：50ml/250ml發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3ml，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為7d。圖2菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的生長(zhǎng)情況c.發(fā)酵產(chǎn)酶曲線初步篩選出能夠產(chǎn)漆酶的菌株后用發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，在發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)3天后開(kāi)始檢測(cè)酶活，經(jīng)過(guò)ABTS-分光光度計(jì)法檢測(cè)得出在3d菌株開(kāi)始產(chǎn)漆酶并且逐漸增加，菌株產(chǎn)漆酶量達(dá)到最高的是在發(fā)酵后的第6天。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析得到菌株產(chǎn)漆酶酶活最高為5.33U。圖3吸光值的變化注：橫坐標(biāo)每間隔反應(yīng)時(shí)間為15s，縱坐標(biāo)為OD值變化根據(jù)上述酶活計(jì)算方法，得出三種酶活分別為：系列1菌株為5.33U，系列2菌株為5.06U，系列3菌株為1.33U。不同的菌株的產(chǎn)漆酶量不同，從中選取產(chǎn)酶量最高的菌株進(jìn)行菌株鑒定。在測(cè)漆酶活的過(guò)程中，取吸光值變化范圍在0.2-0.8之間的有效數(shù)值。在測(cè)漆酶活性的過(guò)程中需要快速添加試劑，保證ABTS不被氧化，否則會(huì)導(dǎo)致測(cè)得反應(yīng)的OD值有誤。d.電泳圖譜分析圖4瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析用改良CTAB法提取待測(cè)菌株全基因組后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外照射下可以看到DNA電泳圖譜。e.序列比對(duì)結(jié)果分析圖5DNA峰形圖圖6菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)測(cè)序公司測(cè)序返回?cái)?shù)據(jù)之后，用DANMAN查看測(cè)序堿基，Chromas可以用來(lái)查看DNA的峰形圖，進(jìn)行序列比對(duì)之后得出該菌株為溶血葡萄球菌JCSC1435（StaphylococcushaemolyticusJCSC1435）。6討論和小結(jié)討論在整個(gè)篩菌過(guò)程中需要保證無(wú)菌操作，避免雜菌的污染。在初篩過(guò)程中要求方法簡(jiǎn)便、快速、高效，所以篩選方法對(duì)于提高效率非常重要。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)漆酶能催化其特征性底物，生成一種具有顏色反應(yīng)的氧化產(chǎn)物這一特性，選擇了一種簡(jiǎn)便且有效地初篩方法，即以漆酶的特性氧化產(chǎn)物-愈創(chuàng)木酚制成PDA篩選平板，進(jìn)行漆酶高產(chǎn)菌株的篩選。這種篩選方法可以保證生長(zhǎng)的菌株所分泌的蛋白不是其它一些酚類(lèi)氧化酶，而是漆酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常直觀，大大縮短了篩選時(shí)間和篩選工作量。在初篩的過(guò)程中，將土樣梯度稀釋至10-3菌株才會(huì)再生長(zhǎng)，稀釋倍數(shù)越高無(wú)菌株生長(zhǎng)，篩選不到所要的菌株，說(shuō)明土壤中含有的產(chǎn)漆酶菌株很少，篩選困難。本實(shí)驗(yàn)篩選出了產(chǎn)漆酶的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了菌株鑒定。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于某些步驟操作失誤，同時(shí)增加了繁重的篩選菌株的時(shí)間。在采集來(lái)的土壤中能夠產(chǎn)漆酶的菌株本身就甚少，同時(shí)增加了篩選的困難。經(jīng)過(guò)了多次篩選實(shí)驗(yàn)，我們成功篩選出了能夠產(chǎn)生漆酶的菌株，并且進(jìn)行了菌株的鑒定，篩選得到一株產(chǎn)漆酶活性較高的菌株。由于本人實(shí)驗(yàn)水平的限制，本實(shí)驗(yàn)還有諸多不完善的地方，只能初步得出上述結(jié)論，如果想要得到更好的結(jié)論，需要進(jìn)一步做實(shí)驗(yàn)，這樣才能更清楚的了解產(chǎn)漆酶菌株的生化性質(zhì)。小結(jié)本實(shí)驗(yàn)從南昌農(nóng)藥廠土壤中分離篩選出一株能夠產(chǎn)漆酶活性的細(xì)菌菌株，菌株的產(chǎn)酶高峰期出現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后的第6天，最高的產(chǎn)漆酶活為5.33U，并對(duì)該進(jìn)行了鑒定，命名為溶血葡萄球菌JCSC1435（StaphylococcushaemolyticusJCSC1435）。參考文獻(xiàn)[1]CoutoSR,HerreraJLT.IndustrialandbioteachnologicalapplicationsofLaccases:Areview[J].BioteachnologyAdvance,2006,24:500-513[2]RivaSLaccases:blueenzymesforgreenchemistry[J].Trends,inBiotechnology,2006,24(5):219-226[3]王佳玲,余惠生,付時(shí)雨等。1白腐菌漆酶研究進(jìn)展[J]。1微生物學(xué)通報(bào),1998,25(4):233-236[4]鈔亞鵬,葉軍,錢(qián)世鈞。擔(dān)子菌組成型漆酶產(chǎn)生特性的研究[J]。1微生物學(xué)報(bào),2000,40(6):628-6321[5]初華麗，梁宗琦，韓燕峰。1一株產(chǎn)生漆酶的耐高溫膨大擬青霉大孢變種[J]。1菌種研究,2004,2(3):43-6321[6]BaldrainP.Fungallaccases-occurrenceandproperties[J].FEMSMicrobiologyReviews2005,30(2):215-242[7]諸葛健,王正祥。工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)[M]。北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1994.335-364[8]張敏,肖亞中,王怡平等。1白腐真菌漆酶的固定化及其應(yīng)用研究[J]。1微生物學(xué)通報(bào),2002,29(3):37-421[9]王建鋒,蘇國(guó)成,劉建玲等。煙管菌漆酶合成的營(yíng)養(yǎng)條件研究[J]。食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(2):20-24[10]張瑞福,曹慧,崔由利等。土壤微生物總DNA的提取和純化微生物學(xué)報(bào),2003,43(2):276-282[11]韓利剛,袁毅,王罡。絲狀真菌組織DNA的提取.生物技術(shù),1999.9(6):38-41[12]王劍鋒。真菌漆酶高產(chǎn)菌株的篩選、發(fā)酵及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D]。西安.西北大學(xué),2006[13]萬(wàn)云洋,杜予民。漆酶結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理[J]?；瘜W(xué)通報(bào),2007(9):622-670[14]陳輝,張劍波,劉小鵬。漆酶催化降解氯酚類(lèi)有機(jī)污染物[J]。北京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,41(4）:17-22[15]丁莉。漆酶對(duì)染料降解的研究[D]。蘇州.蘇州大學(xué),2007致謝首先，誠(chéng)摯的感謝我的論文指導(dǎo)老師徐波老師，對(duì)我的論文的指導(dǎo)和修改。感謝教過(guò)我的所有老師們，在我大學(xué)學(xué)習(xí)的過(guò)程中，授予知識(shí)。在他們的指導(dǎo)下，我才能順利地完成畢業(yè)論文。在此向所有的老師致以真摯的感謝。感謝我的家人對(duì)我的默默支持，感謝在大學(xué)中陪在我身邊的朋友。感謝他們給我提供的幫助。有了他們的支持、鼓勵(lì)，我才能充實(shí)的度過(guò)了四年的學(xué)習(xí)生活。本次實(shí)驗(yàn)是在導(dǎo)師和李燁青學(xué)姐的細(xì)心指導(dǎo)下完成的。感謝生工院為我們提供了實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)，讓我能順利完成這次的畢業(yè)論文。特別感謝徐波老師在本次試驗(yàn)中的細(xì)心指導(dǎo)，幫助我完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作，解決了我在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題和疑惑。同時(shí)感謝李燁青學(xué)姐和實(shí)驗(yàn)同伴對(duì)我的幫助。實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌瓿?，離不開(kāi)各位老師、同學(xué)和朋友的關(guān)心。在此感謝徐波老師的指導(dǎo)和幫助，感謝實(shí)驗(yàn)室的同伴侯玉林、夏宇、佐明的幫助，在此表示深深的感謝，沒(méi)有他們的幫助和支持是沒(méi)有辦法順利完成我的畢業(yè)論文的，愿同學(xué)之間的友誼永遠(yuǎn)長(zhǎng)存。最后祝各位老師、同學(xué)們身體健康，生活幸福！基于C8051F單片機(jī)直流電動(dòng)機(jī)反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機(jī)MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對(duì)良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機(jī)溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機(jī)的通用控制模塊的研究基于單片機(jī)實(shí)現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機(jī)控制的二級(jí)倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強(qiáng)型51系列單片機(jī)的TCP/IP協(xié)議棧的實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的蓄電池自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機(jī)系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機(jī)的作物營(yíng)養(yǎng)診斷專(zhuān)家系統(tǒng)的研究基于單片機(jī)的交流伺服電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)基于單片機(jī)的泵管內(nèi)壁硬度測(cè)試儀的研制基于單片機(jī)的自動(dòng)找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機(jī)的嵌入式系統(tǒng)開(kāi)發(fā)基于單片機(jī)的液壓動(dòng)力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測(cè)儀開(kāi)發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機(jī)實(shí)現(xiàn)一種基于單片機(jī)的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機(jī)的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機(jī)的噴油泵試驗(yàn)臺(tái)控制器的研制基于單片機(jī)的軟起動(dòng)器的研究和設(shè)計(jì)基于單片機(jī)控制的高速快走絲電火花線切割機(jī)床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機(jī)的機(jī)電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開(kāi)發(fā)基于PIC單片機(jī)的智能手機(jī)充電器基于單片機(jī)的實(shí)時(shí)內(nèi)核設(shè)計(jì)及其應(yīng)用研究基于單片機(jī)的遠(yuǎn)程抄表系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的煙氣二氧化硫濃度檢測(cè)儀的研制基于微型光譜儀的單片機(jī)系統(tǒng)單片機(jī)系統(tǒng)軟件構(gòu)件開(kāi)發(fā)的技術(shù)研究基于單片機(jī)的液體點(diǎn)滴速度自動(dòng)檢測(cè)儀的研制基于單片機(jī)系統(tǒng)的多功能溫度測(cè)量?jī)x的研制基于PIC單片機(jī)的電能采集終端的設(shè)計(jì)和應(yīng)用基于單片機(jī)的光纖光柵解調(diào)儀的研制氣壓式線性摩擦焊機(jī)單片機(jī)控制系統(tǒng)的研制基于單片機(jī)的數(shù)字磁通門(mén)傳感器基于單片機(jī)的旋轉(zhuǎn)變壓器-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的研究基于單片機(jī)的光纖Bragg光柵解調(diào)系統(tǒng)的研究單片機(jī)控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機(jī)的多生理信號(hào)檢測(cè)儀基于單片機(jī)的電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)Pico專(zhuān)用單片機(jī)核的可測(cè)性設(shè)計(jì)研究基于MCS-51單片機(jī)的熱量計(jì)基于雙單片機(jī)的智能遙測(cè)微型氣象站MCS-51單片機(jī)構(gòu)建機(jī)器人的實(shí)踐研究基于單片機(jī)的輪軌力檢測(cè)基于單片機(jī)的GPS定位儀的研究與實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機(jī)系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機(jī)的時(shí)控和計(jì)數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機(jī)和CPLD的粗光柵位移測(cè)量系統(tǒng)研究單片機(jī)控制的后備式方波UPS提升高職學(xué)生單片機(jī)應(yīng)用能力的探究基于單片機(jī)控制的自動(dòng)低頻減載裝置研究基于單片機(jī)控制的水下焊接電源的研究基于單片機(jī)的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機(jī)的氚表面污染測(cè)量?jī)x的研制基于單片機(jī)的紅外測(cè)油儀的研究96系列單片機(jī)仿真器研究與設(shè)計(jì)基于單片機(jī)的單晶金剛石刀具刃磨設(shè)備的數(shù)控改造基于單片機(jī)的溫度智能控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)基于MSP430單片機(jī)的電梯門(mén)機(jī)控制器的研制基于單片機(jī)的氣體測(cè)漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機(jī)的CAN/USB協(xié)議轉(zhuǎn)換器基于單片機(jī)和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測(cè)技術(shù)研究基于單片機(jī)的膛壁溫度報(bào)警系統(tǒng)設(shè)計(jì)基于AVR單片機(jī)的低壓無(wú)功補(bǔ)償控制器的設(shè)計(jì)基于單片機(jī)船舶電力推進(jìn)電機(jī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)基于單片機(jī)網(wǎng)絡(luò)的振動(dòng)信號(hào)的采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的大容量數(shù)據(jù)存儲(chǔ)技術(shù)的應(yīng)用研究基于單片機(jī)的疊圖機(jī)研究與教學(xué)方法實(shí)踐基于單片機(jī)嵌入式Web服務(wù)器技術(shù)的研究及實(shí)現(xiàn)基于AT89S52單片機(jī)的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的多道脈沖幅度分析儀研究機(jī)器人旋轉(zhuǎn)電弧傳感角焊縫跟蹤單片機(jī)控制系統(tǒng)基于單片機(jī)的控制系統(tǒng)在PLC虛擬教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用研究基于單片機(jī)系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)通信研究與應(yīng)用基于PIC16F877單片機(jī)的莫爾斯碼自動(dòng)譯碼系統(tǒng)設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的模糊控制器在工業(yè)電阻爐上的應(yīng)用研究基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究與開(kāi)發(fā)基于Cygnal單片機(jī)的μC/OS-Ⅱ的研究基于單片機(jī)的一體化智能差示掃描量熱儀系統(tǒng)研究基于TCP/IP協(xié)議的單片機(jī)與Internet互聯(lián)的研究與實(shí)現(xiàn)變頻調(diào)速液壓電梯單片機(jī)控制器的研究基于單片機(jī)γ-免疫計(jì)數(shù)器自動(dòng)換樣功能的研究與實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的倒立擺控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)單片機(jī)嵌入式以太網(wǎng)防盜報(bào)警系統(tǒng)基于51單片機(jī)的嵌入式Internet系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)單片機(jī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在擠壓機(jī)上的應(yīng)用MSP430單片機(jī)在智能水表系統(tǒng)上的研究與應(yīng)用基于單片機(jī)的嵌入式系統(tǒng)中TCP/IP協(xié)議棧的實(shí)現(xiàn)與應(yīng)用單片機(jī)在高樓恒壓供水系統(tǒng)中的應(yīng)用基于ATmega16單片機(jī)的流量控制器的開(kāi)發(fā)基于MSP430單片機(jī)的遠(yuǎn)程抄表系統(tǒng)及