OUTLINE7.1OpticalMicroscopy7.2ConfocalMicroscopy7.3ApplicationsofConfocalMicroscopyinBiomedicine本文檔共73頁；當前第1頁；編輯于星期五\22點4分7.1OpticalMicroscopyThreegoals:produceamagnifiedimageofthespecimen,separatethedetailsintheimage,renderthedetailsvisibletothehumaneyeorcamera.Simplesinglelensdevicesthatareoftenhand-held,suchasamagnifyingglass.Multiple-lensdesignswithobjectivesandcondensers(compound)本文檔共73頁；當前第2頁；編輯于星期五\22點4分Microscopy:HistorySimpleCompound本文檔共73頁；當前第3頁；編輯于星期五\22點4分Microscopy:History本文檔共73頁；當前第4頁；編輯于星期五\22點4分Microscopy:History本文檔共73頁；當前第5頁；編輯于星期五\22點4分Microscopy:ImportanceBiomedicalsciences:overallmorphologicalfeaturesofspecimens;quantitativetooladvancesinfluorochromestainsandmonoclonalantibodytechniques:explosivegrowthintheuseoffluorescencemicroscopyinbothbiomedicalanalysisandcellbiology.opticalmicroscopemostimportantbiomedicalopticExplosivegrowthinphysicalandmaterialssciences;semiconductorindustry,

observesurfacefeaturesofhigh-techmaterialsandintegratedcircuitsForensicscientists:hairs,fibers,clothing,bloodstains,bullets,andotheritemsassociatedwithcrimes本文檔共73頁；當前第6頁；編輯于星期五\22點4分SimpleMagnificationSo>>>2fSo>2fSo=2ff<So<2f本文檔共73頁；當前第7頁；編輯于星期五\22點4分ImageformationonRetinado~25cm本文檔共73頁；當前第8頁；編輯于星期五\22點4分CombinationofLensandEyeSimplemicroscope:bi-convexlens,imageperceivedbyeyeasifitwereatadistanceof10inchesor25centimeters(nearpoint)Imageappearsonsamesideoflensasobject,cannotbeprojectedontoascreen:virtualimage(upright,notinverted).Lightreflectedfromtheroseentersthelensinstraightlines,refractedandfocusedbythelenstoproduceavirtualimageontheretina.Imageoftherosemagnified:perceiveactualsizeofobjecttobeatinfinity;eyestracelightraysbackinstraightlinestovirtualimage

本文檔共73頁；當前第9頁；編輯于星期五\22點4分CombinationofLensandEyeSofSilLMP=doDatl=f;DecreaselorL,increaseMP:MP=doD+1atl=0;L=doIncreaselorL,decreaseMP(D=1/f);do=nearpt~25cm本文檔共73頁；當前第10頁；編輯于星期五\22點4分CompoundMicroscopeLensclosesttotheobject:objective.Lightfromcondenser,formslightconeconcentratedontotheobject(specimen).Lightpassesthroughthespecimenandintotheobjectiveprojectsareal,inverted,andmagnifiedimageofthespecimentoafixedplanewithinthemicroscope:intermediateimageplane本文檔共73頁；當前第11頁；編輯于星期五\22點4分CompoundMicroscopeLfofeEyeorcameraMP=M(obj)M(e)=(-L/fo)(254/fe)本文檔共73頁；當前第12頁；編輯于星期五\22點4分Airydisksandresolution.(a-c)Airydisksizeandrelatedintensityprofile(pointspreadfunction)asrelatedtoobjectivenumericalaperture,whichdecreasesfrom(a)to(c)asnumericalapertureincreases.(e)TwoAirydiskssoclosetogetherthattheircentralspotsoverlap.(d)Airydisksatthelimitofresolution.Airydisk本文檔共73頁；當前第13頁；編輯于星期五\22點4分Resolutionr=1.2/2NA本文檔共73頁；當前第14頁；編輯于星期五\22點4分7.2ConfocalMicroscopy本文檔共73頁；當前第15頁；編輯于星期五\22點4分PrincipleofConfocalMicroscopy

本文檔共73頁；當前第16頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第17頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第18頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第19頁；編輯于星期五\22點4分PrincipleofCMThekeytechniquetoconfocalmicroscopy

SpatialFilteringTechniquesAdvantages(overconventionalwidefieldopticalmicroscopy)ControldepthoffieldEliminationorreductionofbackgroundinformationawayfromthefocalplaneCapabilitytocollectserialopticalsectionsfromthickspecimens本文檔共73頁；當前第20頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第21頁；編輯于星期五\22點4分HumanMedullaRabbitsunflowerMuscleFiberspollengrain本文檔共73頁；當前第22頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第23頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第24頁；編輯于星期五\22點4分LasersThefarfieldbeginsatadistance,z,definedby(A(0)isthebeamdiameterattheexitapertureandlisthelaserwavelength)z=A02/l

本文檔共73頁；當前第25頁；編輯于星期五\22點4分Wavelength(nm)BeamDiameter(mm)FarFieldDistance(cm)Argon-Ion4880.6745141.0195Helium-Neon5430.4305940.7836120.7806320.778Nd:YAG3553.025355321.0188Ti:Sapphire7902.05063952.010127900.881本文檔共73頁；當前第26頁；編輯于星期五\22點4分Pinhole本文檔共73頁；當前第27頁；編輯于星期五\22點4分ScanningSystem本文檔共73頁；當前第28頁；編輯于星期五\22點4分Detectors本文檔共73頁；當前第29頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrastResponseofAOpticalSystemPointSpreadFunction(PSF)Thepropertiesoftheintensitypointspreadfunctionintheimageplaneaswellasintheaxialdirectionaremajorfactorsindeterminingtheresolutionofamicroscope.IntensitypointspreadfunctionextendsinallthreedimensionsLateralcomponentsoftheintensitydistribution:Airydisk.本文檔共73頁；當前第30頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrast本文檔共73頁；當前第31頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrastOrderZeroCross-ingsPeaksI13.810027.01.7310.20.4413.30.2本文檔共73頁；當前第32頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrast本文檔共73頁；當前第33頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrastInWidefieldMicroscopeRayleighcriterion

forresolutionstatesthattwopointsareresolvedwhenthefirstminimum(zerocrossing)ofoneAirydiskisalignedwiththecentralmaximumofthesecondAirydisk.Thecontrastvalueis26.4percentrlateral=0.6l/NA

本文檔共73頁；當前第34頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrastInconfocalconfigurations

PointwiseIlluminationScanning+PointwiseDetection

PSFconf.=PSFillum.*PSFdetc.~70%*PSFwidefieldTherefore,

rlateral=0.4l/NA

本文檔共73頁；當前第35頁；編輯于星期五\22點4分ResolutionandContrastAxialResolutionWidefieldMicroscope:Noopticalsectioningcapability(a)ConfocalMicroscope:

Opticalsectioningcapability(b)本文檔共73頁；當前第36頁；編輯于星期五\22點4分BenefitsofConfocalMicroscopyReducedblurringoftheimagefromlightscatteringIncreasedeffectiveresolutionImprovedsignaltonoiseratioZ-axisscanning,DepthperceptioninZ-sectionedimagesMagnificationcanbeadjustedelectronically本文檔共73頁；當前第37頁；編輯于星期五\22點4分DrawbacksofConfocalMicroscopySloweracquisition-needtocollectonepixelatatimeIncreasedphotodamage(photobleaching)duetolongerexposuretoexcitinglight本文檔共73頁；當前第38頁；編輯于星期五\22點4分HistoricalPerspective

ThebasicconceptofconfocalmicroscopyMarvinMinskyinthemid-1950s(patentedin1957)

M.DavidEggerandMojmirPetranmultiple-beamconfocalmicroscopeinthelate1960s

M.DavidEggerThefirstmechanicallyscannedconfocallasermicroscopeThefirstrecognizableimagesofcellsin1973.Thelate1970sandthe1980s

Growinginterestinconfocalmicroscopy.本文檔共73頁；當前第39頁；編輯于星期五\22點4分HistoricalPerspectiveApplicationInstrumentsG.FredBrakenhoffdevelopedascanningconfocalmicroscopein1979whilealmostsimultaneously,ColinSheppardcontributedtothetechniquewithatheoryofimageformation.TonyWilson,BradAmos,andJohnWhitenurturedtheconceptandlater(duringthelate1980s)demonstratedtheutilityofconfocalimagingintheexaminationoffluorescentbiologicalspecimens.Thefirstcommercialinstrumentsappearedin1987.Duringthe1990s,thenumberofapplicationsthatcouldbetargetedwithlaserscanningconfocalmicroscopy.本文檔共73頁；當前第40頁；編輯于星期五\22點4分Modernconfocalmicroscopes

Integratedelectronicsystemswheretheopticalmicroscopeplaysacentralroleinaconfigurationoneormoreelectronicdetectors,acomputer(forimagedisplay,processing,output,andstorage)severallasersystemscombinedwithwavelengthselectiondevicesabeamscanningassembly.本文檔共73頁；當前第41頁；編輯于星期五\22點4分ModernconfocalmicroscopesAentireconfocalmicroscopeisoftencollectivelyreferredtoasadigitalorvideoimagingsystemcapableofpro-ducingelectronicimages.Employedforroutineinvestigationsonmolecules,cells,andlivingtissuesnow本文檔共73頁；當前第42頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第43頁；編輯于星期五\22點4分7.3ApplicationsinBiomedicine本文檔共73頁；當前第44頁；編輯于星期五\22點4分熒光探針（Fluorescentprobe）

WhyneedFluorescentprobe?Stainsinfixedtissuesandlivingcells

Labelingantibodieswithfluorescentdyes－Immunofluorescence

Dyes,QuantumDots,….本文檔共73頁；當前第45頁；編輯于星期五\22點4分FluorescenceExcitationandEmissionFundamentals

Luminescence

Photolumine-scence

FluorescencePhosphorescence

單光子激發(fā)熒光本文檔共73頁；當前第46頁；編輯于星期五\22點4分TimescaleRangeforFluorescenceProcessesTransitionProcessRateConstantTimescale

(Seconds)S(0)=>S(1)orS(n)Absorption(Excitation)Instantaneous10-15S(n)=>S(1)InternalConversionk(ic)10-14

to10-10S(1)=>S(1)VibrationalRelaxationk(vr)10-12

to10-10S(1)=>S(0)Fluorescencek(f)orG10-9

to10-7S(1)=>T(1)IntersystemCrossingk(pT)10-10

to10-8S(1)=>S(0)Non-RadiativeRelaxation

Quenchingk(nr),k(q)10-7

to10-5T(1)=>S(0)Phosphorescencek(p)10-3

to100T(1)=>S(0)Non-RadiativeRelaxation

Quenchingk(nr),k(qT)10-3

to100本文檔共73頁；當前第47頁；編輯于星期五\22點4分StokesShiftandMirrorImageRule本文檔共73頁；當前第48頁；編輯于星期五\22點4分WhatisTPA?S1S0S10S1vS1S0S10S1vVirtualStateProcessofTwo-PhotonAbsorption雙光子吸收（TPA）與雙光子激發(fā)熒光本文檔共73頁；當前第49頁；編輯于星期五\22點4分ApplicationsofTPAOpticalpowerlimitingFluorescenceImagingPhotodynamiccancertherapy

Microfabrication3Dopticaldatastorage本文檔共73頁；當前第50頁；編輯于星期五\22點4分雙光子熒光成像（續(xù)）

Hela細胞的雙光子熒光像。染料為trans-4-[p-(9-ethylcarbazde)vinyl]-N-methypyrid-iniumIodide

本文檔共73頁；當前第51頁；編輯于星期五\22點4分量子點

又稱半導體納米微晶粒，直徑在1－100nm之間，能夠吸收激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導體納米顆粒

量子點熒光材料準零維尺度人造原子本文檔共73頁；當前第52頁；編輯于星期五\22點4分量子點的結(jié)構(gòu)（續(xù)）

CoreShellsCoatingPlay本文檔共73頁；當前第53頁；編輯于星期五\22點4分量子點的性質(zhì)與其它發(fā)光材料最大的區(qū)別：一種材料發(fā)多色光1）在發(fā)光范圍內(nèi)為目標光可連續(xù)可調(diào)2）通過調(diào)節(jié)量子點大小對發(fā)光譜調(diào)制Play本文檔共73頁；當前第54頁；編輯于星期五\22點4分我們制備的不同尺寸的CdSe量子點在同一激發(fā)波長（365nm）下發(fā)出的熒光。

實驗結(jié)果本文檔共73頁；當前第55頁；編輯于星期五\22點4分樣品（上圖左起2、4、6）的紫外吸收光譜以及相應的熒光發(fā)射光譜（PL）樣品2、4、6的熒光峰值和FWHM分別為：544.8nm、581.5nm、609.8nm和20.2、17.4、21.9實驗結(jié)果本文檔共73頁；當前第56頁；編輯于星期五\22點4分ApplicationsLSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數(shù)，提供了光學顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)，使細胞生物學研究上了一個臺階。目前我們可以在亞細胞水平進行動態(tài)實驗，檢測細胞生物質(zhì)和離子通道的變化，觀察細胞在生理、病理和藥理情況下對外界因素作用所產(chǎn)生的快速反應，進行定性、定量、定時和定位的分析測量。最常用的功能是細胞三維重建，細胞熒光檢測和細胞顯微操作等

本文檔共73頁；當前第57頁；編輯于星期五\22點4分細胞的三維重建（3-DReconstruction）LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)毎M行分層掃描，得到一組光學切片。通過計算機進行不同的三維重建算法，可作單色或雙色圖象處理，組合成細胞真實的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可不同的斷面觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量細胞的長寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學參數(shù)。通過角度旋轉(zhuǎn)和細胞位置變化可產(chǎn)生三維動畫效果。本文檔共73頁；當前第58頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第59頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第60頁；編輯于星期五\22點4分本文檔共73頁；當前第61頁；編輯于星期五\22點4分細胞定量熒光測定LSCM以激光為光源，對細胞分層掃描，單獨測定，經(jīng)積分后能得到細胞熒光的準確定量，重復性極佳。它適于活細胞的定量分析。適用于快速高靈敏度測量，減少光粹滅的影響，在定量免疫熒光測定方面應用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達的定量分析，監(jiān)測腫瘤相關(guān)抗原表達的定位定量信息，監(jiān)測藥物對肌體免疫功能的作用等。細胞定量熒光測定可選用單熒光。雙熒光和三熒光方式，能自動測定細胞面積，平均熒光強度，積分熒光強度及形狀因子等多種參數(shù)。

本文檔共73頁；當前第62頁；編輯于星期五\22點4分細胞內(nèi)鈣離子PH值和其它離子的動態(tài)分析通過Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calciumgreen、SNARF等多種熒光探針，可對細胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及PH值等作熒光標記并對它們進行比率值和濃度梯度變化測定。由于細胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對細胞生長分化起著重要作用，通過對細胞內(nèi)鈣離子和其它離子的熒光強度和分布精確測定，測定樣品達到毫秒級的快速變化。借助光學切片功能可以測量樣品深層的熒光分布以及細胞光學切片的生物化學特性的變化。本文檔共73頁；當前第63頁；編輯于星期五\22點4分細胞胞間通訊（CellCommunication）和膜的流動性動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通訊在細胞增殖和分化中起著重要作用。通過測量細胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用及細胞內(nèi)鈣離子、pH值等對縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測環(huán)境毒素和藥物在細胞增殖和分化中所起到的作用。細胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，這種有序的運動自由度取決于熒光分子周圍的膜流動性，所以極性測量能間接反映細胞膜的流動性。

本文檔共73頁；當前第64頁；編輯于星期五\22點4分熒光光漂白恢復（Fluorescence