1移液器的使用與校準(zhǔn)本文檔共172頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)用移液器的使用移液器基本上替代了過去的玻璃刻度吸管，作為一種方便有效的精密計(jì)量器材已廣泛用于各類實(shí)驗(yàn)。

基本原理：依靠活塞的上下移動(dòng)實(shí)現(xiàn)吸液和放液。科研人員的基本功，是科學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步，熟練掌握是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可靠的前提和條件。目前實(shí)驗(yàn)室常用的移液器主要有空氣移液器，活塞正移液器，多道移液器以及電子移液器。本文檔共172頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分[Imageinformationinproduct]Notetocustomers:ThisimagehasbeenlicensedtobeusedwithinthisPowerPointtemplateonly.Youmaynotextracttheimageforanyotheruse.實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分正確的安裝錯(cuò)誤的安裝卸掉Tip頭Tip頭的安裝和卸掉實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分1.移液之前，要保證相同溫度。吸取液體時(shí)，保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下2－3毫米。在吸液之前，可以先吸放幾次液體以潤濕吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度與水不同的液體時(shí)）切忌Tip頭在液體里吹泡泡。一是前進(jìn)移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停點(diǎn)，然后慢慢松開按鈕回原點(diǎn)。接著將按鈕按至第一停點(diǎn)排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)吹出殘余的液體。最后松開按鈕。二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體。移液的方法

實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分千萬不要將旋鈕旋出量程移液器在不同使用情況下的存在的問題從大體積調(diào)節(jié)至小體積時(shí)，為正常調(diào)節(jié)方法，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度即可，從小體積調(diào)節(jié)至大體積時(shí)，可先順時(shí)針調(diào)至超過設(shè)定體積的刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，可保證最佳的精確度。（見圖1）實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分你的移液器準(zhǔn)確嗎？？-------移液器的精準(zhǔn)性檢測(cè)

？不同量程范圍的移液器的校準(zhǔn)方法<1μl應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)≥1μl用精密分析天平測(cè)定重量1-10μl從預(yù)裝蒸餾水的稱量管中取出一定量蒸餾水，進(jìn)行扣除計(jì)算的方法稱量

>10μl用預(yù)潤的吸頭將蒸餾水加入稱量管中的方式稱重，多道移液器用預(yù)潤的吸頭加入稱量管中的方式稱重，每一通道都要進(jìn)行校準(zhǔn)（根據(jù)水在20℃時(shí)的密度0.9982計(jì)算體積）實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分你的移液器準(zhǔn)確嗎？？-------移液器的精準(zhǔn)性檢測(cè)

？

移液器允許誤差和測(cè)量的重復(fù)性標(biāo)容量/uL檢定點(diǎn)/ul容量允許誤差±（%）測(cè)量重復(fù)性≤（%）

0.1201010.52010

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0.2201021126

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112610584

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10841005031.5

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10021100050010.5

100010.5實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)材料

儀器：電子天平試劑：蒸餾水移液器(P1000/P200/P20)尖端管（槍頭）(1000ul/200ul)

小量杯

實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作1、選擇1000P、200P、20P的移液器。2、反復(fù)練習(xí)怎樣使用移液器。3、將小量杯放到電子天平中，并將天平調(diào)零。實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)步驟1、調(diào)節(jié)微量移液器，使讀數(shù)顯示為所要取液體的體積。2、吸取液體。3、將吸取的液體放入稱量瓶中。4、觀察電子天平，并記錄數(shù)值。5、每次用天平讀取數(shù)值后要清零。6、按下吸液管活塞下側(cè)的按鈕，將尖端管退到垃圾桶中。實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：容量允許誤差±（%）【（平均體積-理想體積）/理想體積】X100測(cè)量重復(fù)性≤（%）【（測(cè)量體積-平均體積）/平均體積】X100實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分

移液器允許誤差和測(cè)量的重復(fù)性標(biāo)容量/uL檢定點(diǎn)/ul容量允許誤差±（%）測(cè)量重復(fù)性≤（%）

0.1201010.52010

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204220010021

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10021100050010.5

100010.5實(shí)驗(yàn)用移液器的使用本文檔共172頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分禹曉童，楊燕琳，陳櫟北京大學(xué)第三醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室2016-12-3組織學(xué)技術(shù)

及免疫組織化學(xué)本文檔共172頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分中心實(shí)驗(yàn)室組織病理學(xué)分析平臺(tái)平臺(tái)設(shè)備工作內(nèi)容地點(diǎn)辦公電話組織病理學(xué)技術(shù)和形態(tài)學(xué)分析全套先進(jìn)的病理切片制作和圖像分析設(shè)備協(xié)助研究生和科研人員進(jìn)行組織病理學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、技術(shù)指導(dǎo)和服務(wù)科研樓8樓本文檔共172頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分全套病理分析設(shè)備本文檔共172頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分本文檔共172頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分專業(yè)技術(shù)人員黃琛講師，博士，博士后專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)。主要從事干細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤病理學(xué)與腫瘤基因組學(xué)、基因芯片生物信息學(xué)分析等方面研究。楊燕琳主管技師專業(yè)：病理學(xué)技術(shù)。負(fù)責(zé)病理學(xué)教學(xué)、科研和外檢。陳櫟技士負(fù)責(zé)科研臨床病理制片及免疫組化。禹曉童技師專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)。負(fù)責(zé)臨床病理制片及免疫組化、特殊染色。本文檔共172頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)特殊染色本文檔共172頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)本文檔共172頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分第一個(gè)問題：為什么選擇采用免疫組織化學(xué)技術(shù)這種實(shí)驗(yàn)方法？本文檔共172頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分導(dǎo)師安排課題研究A因素與B疾病/病變/狀態(tài)的關(guān)系KeywordsA因素B疾病/病變/狀態(tài)相互關(guān)系冠狀動(dòng)脈粥樣硬化α-平滑肌肌動(dòng)蛋白本文檔共172頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分查文獻(xiàn)、看綜述本文檔共172頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分B疾病/病變/狀態(tài)A因素A因素是什么與類似疾病或病變的關(guān)系定義病因病理和分類臨床表現(xiàn)疾病分期輔助檢查診斷和鑒別診斷治療和預(yù)后本文檔共172頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DNAmRNA蛋白質(zhì)A因素A因素是什么類似疾病或病變中的變化本文檔共172頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DNAmRNA蛋白質(zhì)本文檔共172頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DNA基因序列單一基因？家族？是否存在亞型？單核苷酸多態(tài)性(SNP)堿基突變?nèi)旧w定位本文檔共172頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DNA基因序列單一基因？家族？是否存在亞型？染色體定位NCBI檢索本文檔共172頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DNA基因序列單核苷酸多態(tài)性(SNP)堿基突變高通量檢測(cè)低通量檢測(cè)微陣列芯片高通量測(cè)序PCR后，SSCP、RFLP、測(cè)序原位雜交實(shí)時(shí)熒光定量PCR-SNP基因分型分析少樣本，多基因初篩多樣本，單基因本文檔共172頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分mRNA剪接變異體表達(dá)量高通量檢測(cè)低通量檢測(cè)微陣列芯片高通量測(cè)序原位雜交RT-PCR少樣本，多基因，初篩多樣本，單基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR本文檔共172頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分蛋白表達(dá)量細(xì)胞內(nèi)定位改變翻譯后修飾蛋白檢測(cè)原理：將待測(cè)的目標(biāo)蛋白當(dāng)作抗原，采用特定的商品化抗體，以抗原-抗體結(jié)合的免疫反應(yīng)為原理，使抗體與待測(cè)目標(biāo)蛋白結(jié)合，再利用顯色劑、熒光指示劑等方式，顯示蛋白的表達(dá)量或定位。WesternBlottingFCMELISA免疫組化免疫熒光本文檔共172頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分蛋白表達(dá)量細(xì)胞內(nèi)定位改變翻譯后修飾細(xì)胞內(nèi)定位改變本文檔共172頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分WesternBlotting細(xì)胞、組織定性、定量本文檔共172頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分FCM懸浮細(xì)胞定性、定量同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)本文檔共172頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分ELISA細(xì)胞液、上清液、組織液定量本文檔共172頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組化免疫熒光本文檔共172頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組化免疫熒光原位、定性、定量（光密度、陽性細(xì)胞表達(dá)率）可雙染原位、定性、定量（陽性細(xì)胞表達(dá)率）、可雙染本文檔共172頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分WesternBlotting免疫組化有時(shí)，免疫組化的差異在WB中無法體現(xiàn)。本文檔共172頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分中心法則(CentralDogma)單核苷酸多態(tài)性堿基突變剪接變異體表達(dá)量表達(dá)量細(xì)胞內(nèi)定位改變翻譯后修飾PCR后，SSCP、RFLP、測(cè)序RT-PCR、定量PCRWesternBlotting原位雜交原位雜交FCMELISA免疫組化免疫熒光熒光定量PCR階段性總結(jié)本文檔共172頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)原位蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，以免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)為原理，運(yùn)用物理和化學(xué)方法顯示抗原-抗體反應(yīng)結(jié)果，形成可見的最終有色產(chǎn)物，在對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察的同時(shí)，對(duì)組織和細(xì)胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)。本文檔共172頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分原位蛋白質(zhì)檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)物理和化學(xué)方法顯示反應(yīng)結(jié)果，形成可見產(chǎn)物形態(tài)學(xué)觀察定位、定性、定量本文檔共172頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗原抗體反應(yīng)抗原（antigen，Ag）：能啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答，并與其應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。特征免疫原性：引起抗體形成的能力。反應(yīng)原性：可與其誘發(fā)生成的相應(yīng)抗體發(fā)生特異

性結(jié)合反應(yīng)。耐受原性：在一定條件下又可以阻礙抗體的形成。待測(cè)蛋白=抗原組織切片細(xì)胞爬片本文檔共172頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗原抗體（antibody，Ab）：機(jī)體受到抗原刺激，通過體液免疫應(yīng)答，B細(xì)胞活化、增殖、分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌僅與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。第一抗體(一抗)本文檔共172頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分商品化抗體多克隆抗體單克隆抗體本文檔共172頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分多克隆抗體

(polyclonalantibody，pAb)血清抗體，是機(jī)體接受抗原主動(dòng)或被動(dòng)免疫后，從血清中分離提純的抗體。本文檔共172頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分分泌抗體抗原注射入動(dòng)物體內(nèi)1抗原激活B細(xì)胞抗原B細(xì)胞2形成記憶性B細(xì)胞克隆3a形成漿細(xì)胞克隆3b抽取含有抗體的血清，分離、純化后獲得多克隆抗體5生成來源于不同B細(xì)胞的多克隆抗體4本文檔共172頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分單克隆抗體

(monoclonalantibody，mAb)mAb由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生，只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇，所有抗體分子在結(jié)構(gòu)上完全一致，具有高度特異性和穩(wěn)定性。本文檔共172頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗原注射入動(dòng)物體內(nèi)1脾臟2分離脾臟B細(xì)胞人骨髓瘤細(xì)胞融合3B細(xì)胞與體外培養(yǎng)的人骨髓瘤細(xì)胞株融合選擇性細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞存活B細(xì)胞和人骨髓瘤細(xì)胞死亡45雜交瘤A雜交瘤B雜交瘤C雜交瘤D單個(gè)雜交瘤細(xì)胞形成克隆6mAbAmAbBmAbCmAbD單個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆分泌單克隆抗體本文檔共172頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分物理和化學(xué)方法顯示反應(yīng)結(jié)果，形成可見產(chǎn)物能與抗體形成牢固的共價(jià)鍵結(jié)合不影響抗原抗體結(jié)合具有信號(hào)放大效應(yīng)發(fā)光或顯色反應(yīng)主要發(fā)生在抗原一抗體結(jié)合原位，并與周圍有較高對(duì)比度。標(biāo)記物抗原抗原抗體結(jié)合形成Ag-Ab復(fù)合物本身不可見，必將抗體加以標(biāo)記，利用標(biāo)記物發(fā)光，或與其他物質(zhì)的反應(yīng)才能形成可見發(fā)光或顯色。一抗本文檔共172頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分辣根過氧化物酶HRP堿性磷酸酶AP葡萄糖氧化酶GOD優(yōu)點(diǎn)穿透力強(qiáng)，穩(wěn)定，特異性高，不溶性好底物多，敏感性高，顯色時(shí)間范圍寬終產(chǎn)物穩(wěn)定，易永久保存缺點(diǎn)特異性受內(nèi)源性過氧化物酶影響分子大，穿透力弱，受內(nèi)源性AP干擾分子大，穿透力弱，與底物反應(yīng)敏感性低適用范圍IHC，WB原位雜交，雙重酶標(biāo)IHC，原位雜交，WB，ELISA等顯色劑DAB(棕黃)，AEC(紅，水溶性封片劑)BCIP/NBT(藍(lán))，快藍(lán)(藍(lán))，快紅(紅)，水溶性封片劑NBT，TNBT，INT常用抗體標(biāo)記酶標(biāo)記物顯色本文檔共172頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分熒光標(biāo)記物異硫氰酸熒光素(FITC)異硫氰酸羅丹明(TRITC)Cy3Cy5標(biāo)記物發(fā)光本文檔共172頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分+二抗標(biāo)記物1標(biāo)記物與二抗結(jié)合標(biāo)記的二抗抗原一抗+2一抗與抗原結(jié)合3二抗與一抗結(jié)合4標(biāo)記物自發(fā)光或顯色本文檔共172頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑本文檔共172頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑5S原則Specificity：特異性，最重要Sensitivity：敏感性Simplicity：簡便性Safety：安全性Save：省時(shí)省錢本文檔共172頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑1.抗體公司網(wǎng)站，查詢抗體不建議選擇羊來源的一抗做免疫組化，不建議使用santacruz公司的抗體說明書明確寫出可做石蠟標(biāo)本本文檔共172頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分2.下載抗體說明書，仔細(xì)閱讀，選定一抗抗體來源QuantitysizeBackgroundSpecificityFormatApplicationContentsStorageReference來源動(dòng)物種屬單克??？多克??？夠用？浪費(fèi)？蛋白功能細(xì)胞定位IgG？IgM？反應(yīng)種屬液體？粉末？可用于的檢測(cè)方法、參考濃度范圍抗體產(chǎn)生方式溫度時(shí)間使用該抗體的文章本文檔共172頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑抗體來源QuantitysizeBackgroundSpecificityFormatApplicationContentsStorageMouse單克隆100μl胞漿蛋白IgG大鼠、人液體IHC,50-500腹水4℃1年Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德本文檔共172頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑DAKO,Envision系統(tǒng)中杉,PV-600系統(tǒng)抗體來源反應(yīng)動(dòng)物種屬反應(yīng)的球蛋白種類標(biāo)記物標(biāo)記酶來源動(dòng)物種屬與一抗來源的動(dòng)物反應(yīng)生物素？0.001-0.01g/L卵白素去除內(nèi)源性生物素IgG？IgM？HRP？AP？過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型工作液反應(yīng)底物溶液中加入左旋咪唑，抑制內(nèi)源性AP活性本文檔共172頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑中杉,PV-6002抗體來源反應(yīng)動(dòng)物種屬反應(yīng)的球蛋白種類標(biāo)記物標(biāo)記酶SheepMouseIgGHRP過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶本文檔共172頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)DAB(二氨基聯(lián)苯胺)HRP在過氧化物酶的催化下，電子供體AEC生成穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物不溶于水，但溶解于有機(jī)溶劑。水性封片劑在過氧化氫的存在下，DAB失去電子顯色并累積，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物，并不溶于水和醇類溶液。本文檔共172頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DABAEC本文檔共172頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑BCIP/NBTAP水性封片劑在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會(huì)被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，產(chǎn)物與NBT反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的產(chǎn)物。BCIP:

5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽NBT:Nitrobluetetrazolium

chloride，氯化硝基四氮唑藍(lán)快紅，快藍(lán)在堿性磷酸酶的催化下，快紅或快藍(lán)生成穩(wěn)定的紅色或藍(lán)色產(chǎn)物，不溶于水，但溶解于有機(jī)溶劑。本文檔共172頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分CEA，BCIP/NBTER，快紅本文檔共172頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑DAB(二氨基聯(lián)苯胺)HRP在過氧化氫的存在下，DAB失去電子顯色并累積，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物，并不溶于水和醇類溶液。本文檔共172頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德DAB(二氨基聯(lián)苯胺)中杉,PV-6000HOMEWORK動(dòng)手實(shí)驗(yàn)?本文檔共172頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分選擇一抗選擇二抗系統(tǒng)選擇顯色劑Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德DAB(二氨基聯(lián)苯胺)中杉,PV-6000HOMEWORK動(dòng)手實(shí)驗(yàn)?NO!!本文檔共172頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備臨床樣本動(dòng)物模型培養(yǎng)細(xì)胞獲得標(biāo)本熟悉實(shí)驗(yàn)操作試劑耗材訂購標(biāo)本準(zhǔn)備制定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃IHC本文檔共172頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分標(biāo)本IHC組織取材與固定組織病理制片技術(shù)本文檔共172頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，確定取材、固定方案本文檔共172頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分組織細(xì)胞取材固定的基本流程組織取材光鏡：HE染色特殊染色免疫組織化學(xué)(IHC)原位雜交(ISH)電鏡：IHC蛋白質(zhì)、核酸提取分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-20℃保存免疫熒光(IF)、IHC、ISH冰凍包埋石蠟包埋凍存冰凍切片冰凍切片石蠟切片固定不固定臨床手術(shù)切除、活檢穿刺、尸體解剖、動(dòng)物模型標(biāo)本固定本文檔共172頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分活細(xì)胞光鏡：HE染色特殊染色免疫組織化學(xué)(IHC)原位雜交(ISH)電鏡：IHC蛋白質(zhì)、核酸提取分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)固定IF、流式細(xì)胞術(shù)凍存細(xì)胞爬片細(xì)胞培養(yǎng)外周血、胸腹水和腦脊液手術(shù)切除、活檢穿刺、動(dòng)物模型標(biāo)本細(xì)胞離心涂片細(xì)胞離心后包埋制片細(xì)胞懸液本文檔共172頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分做特定實(shí)驗(yàn)前，必須進(jìn)行HE染色觀察組織質(zhì)量組織有夾痕組織脫水本文檔共172頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分熟悉實(shí)驗(yàn)操作IHC實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)本文檔共172頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復(fù)染分化、返藍(lán)上行脫水透明封片劑封片可選本文檔共172頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化蠟不溶于水，不與抗體、染料相融合。必須徹底清除干凈切片上的蠟，否則將影響染色，造成切片染色不均。二甲苯用于溶解切片中的石蠟，乙醇用于洗脫二甲苯。二甲苯可以溶解于乙醇中。再用水置換出乙醇，水化切片，染料或抗體才能進(jìn)入細(xì)胞中，進(jìn)行染色或反應(yīng)。(1)將石蠟切片60℃干烤2hr，或37-40℃干烤過夜。(2)將石蠟切片浸入二甲苯替代物15min×3次，無水乙醇5min×2次，95%乙醇5min×2次，80%乙醇5min。(3)蒸餾水中浸泡2min。本文檔共172頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶切片浸入新鮮配制的3%甲醇-H2O2避光孵育10-15min。組織細(xì)胞（如紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞、出血壞死組織）中含有內(nèi)源性過氧化物酶，DAB顯色時(shí)，可以與HRP一樣催化底物，使之顯色H2O2溶液可與過氧化物酶反應(yīng)，而甲醇對(duì)各種酶都有鈍化作用，因此3%甲醇-H2O2溶液的雙重作用效果較好。本文檔共172頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌自來水沖洗，蒸餾水5min×2次，PBS

5min×3次。PBS需提前配制，調(diào)PH值。中杉金橋PBS粉末，。本文檔共172頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)目的：暴露抗原。原因：固定液和石蠟導(dǎo)致組織蛋白的氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成醛鍵，或發(fā)生蛋白交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)空間阻礙，從而封閉抗原決定簇。方法：酶消化法：0.1%胰蛋白酶、0.4%胃蛋白酶液、0.1%鏈霉蛋白酶某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）需用酶消化法。胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化?？乖瓱嵝迯?fù)：高溫高壓修復(fù)、煮沸修復(fù)、微波修復(fù)[0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)

]本文檔共172頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分高溫高壓熱修復(fù)：(1)取一定量的0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）于壓力鍋中。(2)將切片置于耐高溫塑料切片架上，切片位于液面以下，蓋鍋加閥，高火加熱至加壓閥快速噴氣，調(diào)電爐至100度計(jì)時(shí)2min。(3)壓力鍋離開熱源，沖水快速冷卻開蓋，晾涼至室溫。修復(fù)液使用前恢復(fù)到室溫。熱處理后，切片自然冷卻，并防止切片干燥。應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法。一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間一定保持一致。注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變(過度高溫修復(fù)會(huì)破壞胞漿和胞核，出現(xiàn)核破裂、蘇木素淡染等現(xiàn)象。過度酶水解對(duì)胞漿的破壞視消化時(shí)間而異，但核破壞較輕)。如果在常用緩沖液中無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或添加螯合劑如EDTA等，可改善某些抗原的修復(fù)。操作注意事項(xiàng)本文檔共172頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌取出切片，PBS

5min×3次。本文檔共172頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉可選細(xì)胞表面（特別是淋巴造血組織，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，組織細(xì)胞表面）存在Fc受體，可與抗體(Ig)結(jié)合，形成非特異性染色。主要是與二抗的非特異性結(jié)合。二抗來源動(dòng)物種屬的正常血清可避免抗體(Ig)與Fc受體結(jié)合。5%二抗來源動(dòng)物種屬的正常血清或5%牛血清白蛋白(BSA)，可避免抗體蛋白吸附于組織切片中高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上，用于封閉組織切片的蛋白疏水基團(tuán)。滴加正常血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，勿洗。本文檔共172頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育滴加50-100μl一定稀釋濃度的一抗工作液于組織上，4℃過夜或37℃2小時(shí)。液體邊緣大于組織邊緣3mm實(shí)驗(yàn)切片：一定稀釋度的一抗陰性對(duì)照片：PBS陽性對(duì)照片：一定稀釋度的一抗本文檔共172頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分一抗的稀釋度一抗稀釋度1:50一抗稀釋度1:500本文檔共172頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗體稀釋液必須根據(jù)說明書要求，如無特殊要求可以采用商品化的一抗稀釋液，或PBS。根據(jù)抗體說明書要求存放抗體。分裝使用的tube和tip必須是消毒滅菌的。分裝體積根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)情況確定。一抗的稀釋、分裝和儲(chǔ)存本文檔共172頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育洗滌取出切片，PBS

5min×3次。本文檔共172頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌滴加50-100μl二抗工作液于組織上，室溫30min。液體邊緣大于組織邊緣3mm本文檔共172頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌取出切片，PBS

5min×3次。本文檔共172頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液根據(jù)DAB顯色試劑盒說明書：每毫升A液（DAB稀釋液）中加1滴（或20μl）B液（DAB原液）的濃度配制所需要的用量，混勻后備用。避免強(qiáng)光照射。本文檔共172頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色本文檔共172頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DAB顯色滴加顯色劑DAB工作液50-100μl，光鏡下控制顯色。事先準(zhǔn)備自來水，工作臺(tái)鋪報(bào)紙。顯微鏡事先調(diào)整到相應(yīng)視野范圍（用HE染色切片，10X）。切片擦干后滴入DAB。定時(shí)器記時(shí)（正記時(shí)）。顯色完成后及時(shí)放入自來水清洗。顯色后清理工作區(qū)，關(guān)閉顯微鏡。本文檔共172頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DAB顯色時(shí)間第一抗體1:501:1001:2001:40015

s++(－)++(－)+(－)(－)30s++++(±)+++(±)+++(－)+(－)45s++++(+)+++(+)+++(±)+(－)60s++++(++)++++(++)+++(+)+(－)注：陽性強(qiáng)度與背景染色以“+”表示，括號(hào)內(nèi)為背景染色。DAB顯色時(shí)間的棋盤測(cè)定法本文檔共172頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分DAB顯色時(shí)間第一抗體1:501:1001:2001:40015

s++(－)++(－)+(－)(－)30s++++(±)+++(±)+++(－)+(－)45s++++(+)+++(+)+++(±)+(－)60s++++(++)++++(++)+++(+)+(－)注：陽性強(qiáng)度與背景染色以“+”表示，括號(hào)內(nèi)為背景染色。DAB顯色時(shí)間的棋盤測(cè)定法本文檔共172頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌顯色完全后，自來水沖洗終止顯色。本文檔共172頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復(fù)染本文檔共172頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分細(xì)胞核內(nèi)脫氧核糖核酸（DNA）呈酸性，易與帶正電荷的蘇木精堿性染料結(jié)合。蘇木素在堿性溶液中呈藍(lán)色，故細(xì)胞核被染成藍(lán)色。切片浸入蘇木素染液，染色時(shí)間根據(jù)染液要求確定。如蛋白表達(dá)需要進(jìn)行光密度測(cè)定，需做兩張免疫組化，一張復(fù)染蘇木素觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞染色，另一張進(jìn)行光密度分析。蘇木素復(fù)染本文檔共172頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復(fù)染分化、返藍(lán)本文檔共172頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分分化：過染的細(xì)胞核和不應(yīng)著染蘇木精的細(xì)胞漿等組織成分脫色，從而使著染的細(xì)胞核與細(xì)胞漿及細(xì)胞周圍的組織成分對(duì)比清晰。分化時(shí)間的長短視組織性質(zhì)，切片厚薄，蘇木素染色深淺和分化液的新舊來決定，一般是2-5秒鐘，若切片不分化或分化不足，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均著染，使組織結(jié)構(gòu)對(duì)比不清晰；若分化過度，細(xì)胞核過淡或褪色。返藍(lán)：堿性溶液使蘇木素恢復(fù)藍(lán)色。1％鹽酸溶液分化，自來水洗滌，再1％氨水返藍(lán)。顯微鏡下觀察復(fù)染情況，可反復(fù)蘇木素復(fù)染、分化、返藍(lán)至滿意結(jié)果。

分化、返藍(lán)本文檔共172頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復(fù)染分化、返藍(lán)上行脫水透明封片劑封片本文檔共172頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分95%乙醇2min×2次，無水乙醇2min×2次，二甲苯替代物5min×2次脫水：去除組織細(xì)胞中的水分，利于長久保存和后續(xù)處理。透明：使細(xì)胞的色度及細(xì)胞的重疊不影響鏡下的觀察。上行脫水透明本文檔共172頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶洗滌抗原修復(fù)洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復(fù)染分化、返藍(lán)上行脫水透明封片劑封片本文檔共172頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分中性樹膠封片。切片陰干，避免強(qiáng)光照射。三天后，等樹膠完全干燥后，盡快進(jìn)行圖像采集。蓋玻片保護(hù)標(biāo)本不受機(jī)械損壞或氧化，保護(hù)鏡頭不被標(biāo)本污染，防止細(xì)胞干皺卷曲產(chǎn)生褐色素，使細(xì)胞透明折光性好。用二甲苯調(diào)制的中性樹膠封片。封片方式采用濕封，切片從二甲苯透明完畢后取出后應(yīng)使其帶有部分二甲苯，然后在細(xì)胞中心滴加適量樹膠，再蓋上蓋玻片。這時(shí)滴加中性樹膠切片就能完好封存。封片劑封片本文檔共172頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分

染色前處理取材、脫水、浸蠟、脫鈣組織固定為確保離體組織的抗原性，組織離體后一般在15min內(nèi)固定，固定液體積為組織體積的10-15倍，常溫下固定8-24hr或4℃固定一周，盡快脫水包埋。中性甲醛固定可引起組織抗原決定簇的封閉和交聯(lián)，必須通過抗原修復(fù)進(jìn)行修正。中性甲醛和70%乙醇固定時(shí)間過長，會(huì)造成組織抗原損失，新鮮組織固定一周后抗原丟失嚴(yán)重，幾乎不能被檢出。免疫組織化學(xué)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)本文檔共172頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分防脫片在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作流程中都必須防脫片。黏附載玻片。切片厚度不宜超過5μm，切片后及時(shí)烘烤。使用多聚賴氨酸等玻片黏附劑預(yù)先處理載玻片。染色時(shí)，組織不能干燥，不能長時(shí)間置于緩沖液中。包埋與切片固定后的組織在高溫石蠟中包埋容易導(dǎo)致抗原破壞，需選用低熔點(diǎn)石蠟。切片保存：不能室溫存放，短期4℃存放，長期-20或-80℃存放。脫蠟：必須徹底，否則影響染色。本文檔共172頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗原修復(fù)抗原修復(fù)后的切片應(yīng)充分洗滌，以去除抗原修復(fù)液對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響。熱修復(fù)后的切片應(yīng)自然冷卻。同一批抗原的檢測(cè)時(shí)間和溫度必須保持一致。需注意抗原修復(fù)對(duì)切片組織形態(tài)的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇修復(fù)方法和修復(fù)液。內(nèi)源性過氧化物酶的滅活使用過氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，必須采用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶。本文檔共172頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分血清封閉：二抗來源種屬相同的正常血清。一抗保存：嚴(yán)格按照說明書。一抗與免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)的正確配套酶標(biāo)抗體系統(tǒng)中的酶與顯色劑的合理選用HRP系統(tǒng)采用DAB和AEC顯色。AP系統(tǒng)采用快紅、快藍(lán)或BCIP/NBT顯色復(fù)染：蘇木素或Giemsa對(duì)照染色實(shí)驗(yàn)的合理設(shè)立：必須有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。本文檔共172頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果分析和判斷判斷原則必須設(shè)染色對(duì)照。抗原表達(dá)必須在特定部位。陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性表達(dá)。對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對(duì)化。本文檔共172頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分每一次IHC實(shí)驗(yàn)必須設(shè)定的對(duì)照陽性對(duì)照空白或替代對(duì)照本文檔共172頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分陽性對(duì)照用已證實(shí)含靶抗原的標(biāo)本片與待檢標(biāo)本片同時(shí)做同樣處理染色的組織對(duì)照。陽性標(biāo)本片得到的陽性結(jié)果，表明所用抗體、各種試劑和操作步驟的可靠性，證實(shí)所用IHC染色流程的有效性，排除假陰性的可能。陽性對(duì)照標(biāo)本可選自相同組織樣本，也可選擇不同來源組織，但必須事先證實(shí)含有待測(cè)靶抗原。陽性對(duì)照在每一批IHC染色都不可缺少，且對(duì)同一批的不同靶抗原也應(yīng)分別設(shè)置。本文檔共172頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分陰性對(duì)照陰性試劑對(duì)照-空白或替代對(duì)照用緩沖液或一抗同源動(dòng)物未免疫的正常血清取代一抗的對(duì)照染色。缺少免疫試劑的同步處理和標(biāo)記染色的IHC對(duì)照。用于證實(shí)IHC染色所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性的同步對(duì)照標(biāo)本片染色。每一批IHC染色中絕不可缺少的對(duì)照設(shè)置。本文檔共172頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分骨肉瘤，Ki67骨肉瘤，空白對(duì)照本文檔共172頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分心臟，HE染色本文檔共172頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分心臟，HE染色本文檔共172頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分心臟，HE染色本文檔共172頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分心臟，空白對(duì)照本文檔共172頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分心臟，α-SmoothMuscleActin本文檔共172頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分自身對(duì)照在同一標(biāo)本片上，靶抗原的陽性反應(yīng)與其他無關(guān)成分或結(jié)構(gòu)的陰性結(jié)果可形成鮮明對(duì)照。無需另外步驟或試劑。陽性對(duì)照標(biāo)本可選自相同組織樣本，也可選擇不同來源組織，但必須事先證實(shí)含有待測(cè)靶抗原。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽性或抗原彌散位移所造成的錯(cuò)誤結(jié)果。本文檔共172頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分GAD67，神經(jīng)元標(biāo)記本文檔共172頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗原表達(dá)必須在特定位置陽性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性。不在抗原所在部位的陽性表達(dá)一律不能視為確切的陽性結(jié)果，只能視為陽性著色。難以確定或存在爭(zhēng)議的陽性分布，必須經(jīng)過對(duì)照染色結(jié)果加以證實(shí)。本文檔共172頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分細(xì)胞漿蛋白肝癌Peroxiredoxin3蛋白-棕色，細(xì)胞核-藍(lán)色本文檔共172頁；當(dāng)前第119頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分細(xì)胞核蛋白子宮內(nèi)膜MCM2蛋白-棕色，細(xì)胞核-藍(lán)色本文檔共172頁；當(dāng)前第120頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分細(xì)胞膜蛋白卵巢腺癌ErbB2蛋白-棕色，細(xì)胞核-藍(lán)色本文檔共172頁；當(dāng)前第121頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)陰性結(jié)果不能不加分析的認(rèn)定具有否定意義。陽性表達(dá)具有強(qiáng)弱、多少之分，即使只有少數(shù)細(xì)胞陽性，也要視為陽性表達(dá)。避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性表達(dá)酶免疫標(biāo)記檢測(cè)時(shí)，由于內(nèi)源性酶的干擾，出血壞死區(qū)呈彌漫性成片著色。切痕和組織片周邊，由于界面不平整，標(biāo)記試劑殘留干擾，呈非真實(shí)的抗原陽性標(biāo)記對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對(duì)化當(dāng)IHC結(jié)果與HE切片診斷不一致時(shí)，應(yīng)綜合分析。本文檔共172頁；當(dāng)前第122頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分組織壞死本文檔共172頁；當(dāng)前第123頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分組織折疊本文檔共172頁；當(dāng)前第124頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分實(shí)驗(yàn)序號(hào)待測(cè)樣本陽性組織陰性組織空白對(duì)照結(jié)果判斷1－－－－假陰性，方法不可靠或操作有誤2＋＋＋＋假陽性，非特異染色，需尋找原因3＋＋＋－可疑，陰性組織對(duì)照片選擇不準(zhǔn)確，含有靶抗原4＋－－－可疑，陽性組織對(duì)照片選擇不準(zhǔn)確，不含靶抗原5＋＋－＋假陽性，非特異性染色，與二抗交叉反應(yīng)有關(guān)6＋＋－－陽性，可靠，待測(cè)樣本中含靶抗原7－＋－－陰性，可靠，待測(cè)樣本中不含靶抗原IHC染色結(jié)果分析本文檔共172頁；當(dāng)前第125頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分非特異性染色I(xiàn)HC染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原(或抗體)的顯色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色。組織內(nèi)源性成分的干擾標(biāo)記物的干擾抗體的干擾組織處理不當(dāng)本文檔共172頁；當(dāng)前第126頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分組織內(nèi)源性成分的干擾自發(fā)熒光組織未經(jīng)熒光色素染色，在紫外線或短光波照射下呈現(xiàn)的熒光。膠原纖維和彈性纖維-藍(lán)綠色軟骨和角蛋白-黃綠色脂褐素-棕黃色除結(jié)締組織外，自發(fā)熒光一般較弱，可根據(jù)其形態(tài)和部位進(jìn)行判斷。本文檔共172頁；當(dāng)前第127頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分視網(wǎng)膜色素上皮層與脈絡(luò)膜層CD29蛋白-綠色，脂褐素-黃色，細(xì)胞核-藍(lán)色本文檔共172頁；當(dāng)前第128頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分誘發(fā)熒光某些物質(zhì)天然狀態(tài)下本身不產(chǎn)生熒光，經(jīng)過簡單化學(xué)處理后可轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)射熒光。甲醛固定后的去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺-黃綠色5-羥色胺-黃色。本文檔共172頁；當(dāng)前第129頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分內(nèi)源性過氧化物酶白細(xì)胞及組織內(nèi)含有過氧化物酶，紅細(xì)胞的血紅蛋白也可以產(chǎn)生假過氧化物酶反應(yīng)。內(nèi)源性生物素在新鮮未固定組織的肝、胰、腎等實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性生物素或生物素樣物質(zhì)。本文檔共172頁；當(dāng)前第130頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分紅細(xì)胞非特異性染色本文檔共172頁；當(dāng)前第131頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分標(biāo)記物的干擾熒光素和辣根過氧化物酶熒光素和酶自身質(zhì)量差。親和素親和素為含糖基的堿性蛋白，能與組織中糖蛋白和細(xì)胞的負(fù)電荷發(fā)生非特異結(jié)合，引起背景著色。鏈霉親和素等電點(diǎn)為中性，不含糖基，可避免非特異結(jié)合。本文檔共172頁；當(dāng)前第132頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分抗體的干擾抗體蛋白與組織的非特異吸附主要是物理吸附。應(yīng)用未純化的多克隆抗血清時(shí)更為常見，抗血清中的凝集蛋白也能與組織結(jié)合。免疫原的交叉反應(yīng)用作制備特異性抗體的免疫原(抗原)提取不純或者某些組成成分具有共同的抗原決定簇，由此而生成的抗體會(huì)造成“非期待”的“特異性”結(jié)合。本文檔共172頁；當(dāng)前第133頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分IgG之間的交叉反應(yīng)IgG受體廣泛存在組織內(nèi)，它與IgG的結(jié)合不受種屬限制，近系動(dòng)物之間，尤其是未固定樣本中更易出現(xiàn)這種“非期待”的“特異性”結(jié)合。天然抗體的交叉反應(yīng)動(dòng)物血清中存在多種天然抗體，無種屬特異性，能與多種動(dòng)物的纖維組織發(fā)生反應(yīng)，造成非期待的著色。本文檔共172頁；當(dāng)前第134頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分組織處理不當(dāng)血清或分泌性抗原的干擾血清或分泌物中含有待測(cè)抗原，污染細(xì)胞。組織固定不及時(shí)細(xì)胞抗原彌散，造成定位不確切。組織自溶，增強(qiáng)了抗體蛋白與組織的非特異結(jié)合。操作流程不規(guī)范染色過程中，洗滌不充分造成游離試劑殘留。本文檔共172頁；當(dāng)前第135頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分標(biāo)準(zhǔn)化組織病理圖像采集本文檔共172頁；當(dāng)前第136頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分NakanoT,AndoS,TakataN,KawadaM,MugurumaK,SekiguchiK,SaitoK,YonemuraS,EirakuM,SasaiY.Self-FormationofOpticCupsandStorableStratifiedNeuralRetinafromHumanESCs.CellStemCell.2012,10(6):771-85.JanichP,PascualG,Merlos-SuárezA,BatlleE,RippergerJ,AlbrechtU,ChengHY,ObrietanK,DiCroceL,BenitahSA.Thecircadianmolecularclockcreatesepidermalstemcellheterogeneity.Nature.2011,480(7376):209-14.IF(2010)：25.943IF(2010)：36.101本文檔共172頁；當(dāng)前第137頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分NakanoT,AndoS,TakataN,KawadaM,MugurumaK,SekiguchiK,SaitoK,YonemuraS,EirakuM,SasaiY.Self-FormationofOpticCupsandStorableStratifiedNeuralRetinafromHumanESCs.CellStemCell.2012,10(6):771-85.JanichP,PascualG,Merlos-SuárezA,BatlleE,RippergerJ,AlbrechtU,ChengHY,ObrietanK,DiCroceL,BenitahSA.Thecircadianmolecularclockcreatesepidermalstemcellheterogeneity.Nature.2011,480(7376):209-14.IF(2010)：25.943IF(2010)：36.101背景均一組織結(jié)構(gòu)正規(guī)色調(diào)正常采集部位可充分展示結(jié)果圖像清晰本文檔共172頁；當(dāng)前第138頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分心臟，α-SmoothMuscleActin本文檔共172頁；當(dāng)前第139頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分免疫組化結(jié)果半定量分析陽性細(xì)胞面積（Area）平均光密度值（Density(Mean)）積分光密度值（IntegratedOpticalDensity,IOD）專業(yè)圖像分析軟件Image-ProPlus本文檔共172頁；當(dāng)前第140頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分光密度分析光密度（OD）分析是，通過測(cè)量被傳輸?shù)墓鈹?shù)量（允許通過的）來確定材料中的物質(zhì)含量。因?yàn)镺D分析測(cè)量通過材料的光數(shù)量，所以只有當(dāng)所分析的圖像在進(jìn)行捕捉時(shí)光源是從材料背后輻射出來時(shí)，OD測(cè)試才有意義。例如：從顯微鏡載玻片中捕捉到的圖像（光是從材料的正下方穿過來的）或者在光盒中得到的膠片（光是從箱的背后穿過來的）。對(duì)于在反射光條件下捕捉到的圖像進(jìn)行的分析，光密度測(cè)量沒有絲毫意義。在沒有光穿過材料時(shí)，其光密度為無窮大，而當(dāng)所有的光都穿過了材料時(shí)，其光密度為0。OD隨著強(qiáng)度值的增加而遞減，也就是說，在某個(gè)光密度區(qū)間，陰暗像素對(duì)應(yīng)高的值，而相對(duì)明亮的像素則對(duì)應(yīng)低的值。本文檔共172頁；當(dāng)前第141頁；編輯于星期一\18點(diǎn)37分面積（Area）、平均光密度（MeanDensity）、積分光密度（IOD）作為IPP圖像軟件的測(cè)算結(jié)果，發(fā)現(xiàn)面積（Area）、積分光密度（IOD）較于平均光密度（Density(Mean)）更適合作為測(cè)算結(jié)果使用。尤其是積分光密度（IOD），在IPP中被定義為每個(gè)陽性樣本光密度值和面積乘積之和，相當(dāng)于光密度總和（SumDensity），這與通用的人工計(jì)數(shù)法的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比乘積更為接近。可以采用面積濾過去除雜點(diǎn)。隨著濾過面積的增加，陽性樣本數(shù)減少，相應(yīng)導(dǎo)致Area（Sum）、MeanDensity（Sum）、IOD（sum）的減少，以及Area（Mean）、MeanDensity（Mean）、IOD（Mean）