原位雜交技術(shù)

insituhybridization核酸分子雜交技術(shù)在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。兩條核苷酸單鏈片段，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈分子按其作用方式可大致分為兩種：固相雜交和液相雜交液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交包括：菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）、斑點(diǎn)雜交（Dotblot）、Southern印跡雜交（Southernblot）Northern印跡雜交（Northernblot）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization），即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原位雜交技術(shù)的基本原理利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。1.兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子2.應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P，熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì))DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交3.用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位用原位雜交術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。

Aromasegene

TheratbrainsectionInsituhybridization培養(yǎng)細(xì)胞原位雜交組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展1961年，Hall液相核酸雜交技術(shù)1969年，Gall和Pardue用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。1969年，Buongiorno-Nardelli和AmaldiJohn利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。由于遍同位鉗素標(biāo)桌記探謀針具撇有放爐射性獄既污肥染環(huán)當(dāng)境，把又對(duì)甩人體旗有害存，且但受半秋衰期錫限制槽等缺蔬點(diǎn)，語科學(xué)俗工作孔者們酬開始瓣探索都用非械放射睛性的剪標(biāo)記敏物標(biāo)島記核蛋酸探躁針進(jìn)震行原錘位雜詞交。Ba南um離an（19佛81）等首校先應(yīng)芽用熒光乳素標(biāo)副記cR賓NA探針做原屬位雜叫交，弓然后傍用熒始光顯嚴(yán)微鏡拆觀察羊獲得妙成功雨。Sh衛(wèi)ro嗓ye舞r（19碌82）報(bào)道顛用2，4二硝蕉基苯啞甲醛（DN朱P）標(biāo)記DN蛛A探針，使料該DN惕A探針?biāo)删哂凶隹乖k性，為然后畜用兔閥抗DN殊P的抗避體來振識(shí)別嗚雜交塵后的把探針踏，最庸后經(jīng)啄免疫星過氧孤化物嬌酶的麻方法轎來定隙位雜健交探處針。這兩陵種方錄法至露今仍浴有采庭用，榆但因錢敏感薪度不懇夠高尖，應(yīng)敏用不花夠普谷遍。Pe岡zz壘el右la（19愚87）創(chuàng)建屢了用磺基胡化DN幸A探針來做拾細(xì)胞察或組羽織原瘦位雜炒交的慨方法瞞，其按基本消原理席是使DN爺A探針竄的胞散嘧啶態(tài)堿基除磺基財(cái)化，跡利用但單克詢隆抗普體識(shí)逝別磺腫基化著探針倉，再禽通過餡免疫輝組化安方法睛顯示蔥結(jié)合掠的單蠻克隆請(qǐng)抗體淡，從轟而對(duì)沖雜交孤結(jié)合須的探求針進(jìn)撫行定敗位。本法善的優(yōu)騙點(diǎn)是營磺基餅化DA量N探針禁標(biāo)記齡簡便熊，不扛需作洪缺口替平移膜標(biāo)記裳，敏芒感度理也較運(yùn)高。生物特素標(biāo)劃記探敵針技磁術(shù)是Br肢ig亂at（19候83）首先塌建立華的，笛它利歉用生章物素泉標(biāo)記仇的探片針在茫組織崗切片敢上檢瞇測了鎖病毒DN雞A，通過和生物溝素與解抗生犧物素谷結(jié)合望，過煉氧化寄物酶-抗過載氧化魔物酶掉顯示留系統(tǒng)著顯示衡病毒DN頂A在細(xì)秒胞中熱的定旋位。生物興素標(biāo)移記探民針技遣術(shù)目柏前已冰被廣冊泛應(yīng)淚用，項(xiàng)特別鐘是在殊病毒法學(xué)和再病理絞學(xué)的喝臨床巡壽診斷智中。上述能生物解素標(biāo)濕記技啄術(shù)又敬叫酶電促生帶物素鳴標(biāo)記撫技術(shù)弊。另息一種關(guān)叫光促鳥生物雄素標(biāo)混記核嫩酸技漂術(shù)（19您85），該宮技術(shù)駛是用奶光敏厭生物跟素（Ph夠ot眉o(jì)b必io近ti嫁n）標(biāo)記顯核酸偽。目練前應(yīng)樹用的暈光敏褲生物膊素有傻乙酸括鹽和欠補(bǔ)骨虧脂素夫生物堆素，肆它們翠都是材由三悶個(gè)部喪分組民成：冤光敏脅基團(tuán)塊、連算結(jié)臂邊和生正物素押。在導(dǎo)強(qiáng)光摘下，餐不需棉酶反不應(yīng)，辨光敏絮生物左素的跑光敏蠶基團(tuán)執(zhí)即可烘與核宰酸中打的堿微基相役結(jié)合款。光敏鄙生物肯素標(biāo)永記核召酸，壤方法倘簡單途，靈纏敏度罷也不院低，換但標(biāo)猾記效脊率不秘高，逮每10擱0～15寒0個(gè)堿蠢基才硬能標(biāo)淘記一歷個(gè)生秘物素條，對(duì)滔于短馳的基油因探怠針特聽別是孫寡核灑苷酸山探針略不宜壁使用掙，以琴免因寺標(biāo)記殘數(shù)過梁少而令影響隨靈敏裙度。近年均來，地高原辛（Di波go渠xi濟(jì)go經(jīng)ni仁n）標(biāo)記宿技術(shù)床引起覺科技貸工作興者的刷極大莊興趣踏。Bo彩er遞in逃ge善rMa郵nn債he卡mBi某o－ch劍em醒is面ca于19海87年將扛地高意辛標(biāo)曉記的消有關(guān)蜜試劑編及藥食盒投肌放市侄場。和其嘴它非捆放射京性標(biāo)備記物礎(chǔ)一樣浪，地型高辛歐較放靜射性裝標(biāo)記絕系統(tǒng)附安全胡，方延便、謹(jǐn)省時(shí)猶間。各同時(shí)處在敏衰感性遼和質(zhì)難量控厚制方謝面比膀生物索素標(biāo)倒記技萄術(shù)要似優(yōu)越怪，可魂以檢幸測出休人基墳因組DN謊A中的肉單拷駝貝基納因。械地高副辛標(biāo)辯記法糕顯示嶼的顏社色為賊紫藍(lán)怖色（開標(biāo)記零堿性亮磷酸秧酶-抗堿歸性磷昆酸酶出顯色雖系統(tǒng)員），賊有較垮好的揉反差光背景僻。核酸時(shí)探針襯的分描類核酸和探針渠根據(jù)寨標(biāo)記佳方法塞的不濟(jì)同可個(gè)粗略萬分為趣放射岡性探皮針和批非放畫射性題探針橋兩類缸。根據(jù)治探針痕的核其酸性醋質(zhì)不豪同可殊分為DN勇A探針資、RN蔬A探針置、cD難NA探針志、cR秧NA探針痰和寡炕核苷賤酸探顆針等概。DN童A探針徑還有妥單鏈DN襯A（Si軟ng加le渴s思tr嗎an用de艱d,ss勵(lì)DN戶A）和雙酷鏈DN馬A（Do黎ub承l(wèi)e宇s行tr友a(bǔ)n紙de炊d,ds殺DN芽A）之分微。早期賀應(yīng)用算的主半要是DN調(diào)A探針Te抬mi機(jī)n在70年代假研究晉致癌RN售A病毒譯時(shí)制演備了cD剖NA探針（co問mp嬸le勾me催nt律ar銹y哲DN霧A），其基鹽本原灰理是校以RN某A為模障板，稻經(jīng)逆遭轉(zhuǎn)錄膽酶（re澤ve拔rs奴e還tr城an弟sc能ri披pt肥as椒e）又稱貸為RN讀A指導(dǎo)雙的DN捕A聚合多酶催樓化產(chǎn)除生的哪。該典酶以RN虧A為模也板，浩按照RN碌A(chǔ)的核鉤苷酸歉順序催合成DN浩A，這一呢途徑驗(yàn)與一環(huán)般遺錫傳信固息流傳的方汽向相定反，拋故稱陜逆轉(zhuǎn)秤錄。cD仿NA是指煉互補(bǔ)寨于mR勞NA的DN剩A分子飲。RN芳A探針是將耽特異癥性的cD專NA片段勢插入略含有RN弦A聚合縱酶啟票動(dòng)子傘的轉(zhuǎn)恒錄性辦載體棚。這類脂載體葬包括pS粒P6最4和pS巨P6物5，它們盼具有劍不同吧的啟動(dòng)暴子在多場克隆率位點(diǎn)密的各戚側(cè)。Ps行p6按4和pS團(tuán)P6婦5在sP廢6啟動(dòng)勉子的伙多克茄隆位甘點(diǎn)的擊方向障是不夠同的厘。通恰過改械變外仗源基宴因的咸插入氏方向陰或選偵用不驢同的RN疲A聚合決酶，斑可以她控制RN鐵A的轉(zhuǎn)請(qǐng)錄方旁向，桐即以磁哪條DN呼A鏈為準(zhǔn)模反春轉(zhuǎn)錄RN五A。從而溫可以喚得到笨與mR半NA同序王列的燥同義RN生A探針蜓（Se愁ns刺e占pr猴ob泰e）和與mR姓NA互補(bǔ)聽的反其義RN爪A探針江（an揀ti土se杯ns喘epr勇ob竟e），又稱涉互補(bǔ)RN涌A探針盲（co革mp故le賄me古nt深ar頑y禁RN不A亭pr蜘ob暮e松,cR巖NA）。通常步用同撫義RN鬼A探針錘做為虧反義RN舌A探針險(xiǎn)的陰貨性對(duì)潔照。由于RN巡壽A探針港是單訴鏈分爬子，粥所以蒙它與更靶序仗列的移雜交抹反應(yīng)提極高臨。有泰報(bào)告塘認(rèn)為稼其雜仙交率炎高于DN壯A探針利的8倍。DN死A合成欠儀的漫誕生腥使制挖造寡核清苷酸鈔探針成為傍可能減，與系上述停探針銜不同扛的是搶寡核狗苷酸截探針喇不是今克隆怨性DN扇A探針危，它路是由DN乞A合成乖儀依窮照所續(xù)需雜宅交的母靶核叮苷酸遍序列姑合成臨的。逝具有弓制造吵方便錄，價(jià)籮格低乞廉的幕優(yōu)點(diǎn)惑，也數(shù)可進(jìn)細(xì)行放疾射性畢與非豈放射晃性標(biāo)也記，熱但其麗特異蜜性不雹如克選隆性厲探針擾強(qiáng)，位亦不仔如其賀雜交慚信號(hào)址高。原位傾雜交輸組織?；瘜W(xué)這技術(shù)預(yù)的耽基本喬步驟大致卷可分旗為：①雜魚交前絲式準(zhǔn)備控，包爭括固土定、糠取材瓶、玻島片和醒組織洲的處營理，朋如何突增強(qiáng)稿核酸蹦探針成的穿性透性寺、減充低背盼景染扇色等曲；②雜勿交；③雜以交后邁處理飄；④顯況示（vi協(xié)su肢al養(yǎng)iz蹈at缸io各n）：包括目放射雀性自總顯影道和非繼放射宰性標(biāo)吸記的熱顯色耳。（一禽）固杠定兼顧拘三個(gè)青方面話：保持澇細(xì)胞早結(jié)構(gòu)貌，最大灶限度格地保鉗持細(xì)觀胞內(nèi)DN泰A或RN蠢A的水冰平；使探宰針易宅于進(jìn)姨入細(xì)煙胞或葵組織株。DN棗A是比石較穩(wěn)劇定的拐，mR錄NA卻絕頌然不邪同，伯非常喪容易廉被降狗解。疾因此舟，對(duì)圖于DN游A的定能位來領(lǐng)說，白固定沾劑的怒種類府和濃憐度并麻不十散分重管要。僑相反想，在RN泰A的定幅位上哪，如介果要流使RN始A的降切解減發(fā)少到真最低磚限度浩，那臂么，餓不僅址固定禿劑的拖種類被濃度患和固掌定的恐時(shí)間千十分贊重要穿，而移且取冶材后輛應(yīng)盡案快予坡以冷彈凍或優(yōu)固定憐。在惑解釋IS承HH的結(jié)虹果時(shí)情應(yīng)考演慮到勿取材樓至進(jìn)擔(dān)入固北定劑靠或冰鏟凍這獻(xiàn)段時(shí)論間對(duì)RN蝦A保存刷所帶吼來的巨影響奴，因卡組織中mR隆NA的降緊解是妹很快恐的。在固繞定劑棚中，債最常牛用的急是多聚興甲醛。對(duì)于mR芹NA的定紡位，喉我們盒常采企用的因方法骨是將芬組織蜜固定通于4%多聚本甲醛輸磷酸薪緩沖渴液中1～2h，在冷役凍前鄙浸入15校%蔗糖淹溶液察中，煤置4℃冰箱哪過夜替，次聾日切嫌片或漸保存畏在液憶氮中腿待恒盲冷箱糖切片累機(jī)或潛振蕩買切片急機(jī)切誘片。組織肚也可催在取小材后冊直接洋置入喘液氮神冷凍年，切生片后彈才將箭其浸謹(jǐn)入4%多聚貿(mào)甲醛醒約10禁mi勝n，空氣桂干燥鬼后保磚存在-7均0℃。如瓣冰箱部溫度捏恒定慕，在-7辜0℃可保壇存數(shù)破月之屆久不經(jīng)會(huì)影枯響雜息交結(jié)糧果。在病粉理學(xué)早活檢岔取材熱多用百福爾墨馬林形固定顏和石制蠟包爛埋，物這種首標(biāo)本爐對(duì)檢抖測DN功A和mR剝NA有時(shí)疲也可醒獲得全雜交背信號(hào)葬，但笑石蠟舊包埋屠切片紡由于趕與蛋華白質(zhì)童交叉達(dá)連接且的增附加，述影響掙核酸疏探針飯的穿尤透，恩因而爬雜交倒信號(hào)很常低詢于冰餐凍切像片。童同時(shí)侄，在何包埋腹的過鴨程中鋤可減耕低mR堂NA的含敏量。（二來）玻伶片和躍組織裙切片得的處躬理1．玻聚片的還處理什玻片任包括婦蓋片照和載爹片應(yīng)用段熱肥林皂刷腫洗，爽自來倦水清頂洗干歉凈后縮慧，置扮于清殘潔液呈中浸蹲泡24辰h，清水區(qū)洗凈迅烘干充，95節(jié)%酒精捕中浸清泡24陶h后蒸皺餾水快沖洗鹿、烘粘干，放烘箱殃溫度緩最好癥在15應(yīng)0℃或以談上過兩夜以去覽除任押何RN男A酶。毛蓋玻筒片在味有條業(yè)件時(shí)煮最好斥用硅化處理組，錫床箔紙塑包裹順無塵吵存放晴。由于IS導(dǎo)HH的實(shí)灰驗(yàn)周肺期長帥，實(shí)交驗(yàn)程凍序繁裙雜，絞因此洗，要矮應(yīng)用粘附逼劑預(yù)先繪涂抹吃在玻購片上需，干打燥后從待切衡片時(shí)點(diǎn)應(yīng)用皺，以活保證刻在整葡個(gè)實(shí)找驗(yàn)過嘩程中蚊切片灰不致守脫落陳。常用里的粘較附劑針有鉻礬-明膠液，勺其優(yōu)視點(diǎn)是瓣價(jià)廉帳易得趴，但忙在長順周期尋實(shí)驗(yàn)騰過程麻中，育粘附頭效果薦不夠公理想延。多聚士賴氨貌酸液具送有較侵好的充粘附尸效果明，但冠價(jià)格套昂貴債，需鄰進(jìn)口鵝。近年Ve己ct裕or騰L弱ab右(植U.渾S.廟A.小)推出壘一種認(rèn)新的傻粘附伍劑叫Ve籮ct僑or漠ba攀ndRe陜ag設(shè)en爺t,每一航單位拉包裝床可制辭備50策0～70荒0張載彈玻片第，粘刮附效咸果極嶺佳，顫價(jià)格申較多揪聚賴滿氨酸巧便宜乳，制掠片后療可長乘期保乏存應(yīng)乓用。2．增學(xué)強(qiáng)組擔(dān)織的法通透懶性和咳核酸布探針醋的穿透酷性此步柱驟根濃據(jù)應(yīng)聞?dòng)霉倘▌╇s的種疾類、渠組織吩的種叨類、欠切片獅的厚則度和嗓核酸舌探針子的長靠度而備定。增強(qiáng)廉組織泳通透蕉性常謠用的槳方法航如應(yīng)慚用稀畏釋的套酸洗托滌、蓮去垢雜劑（de冊te擇rg得en筐t）或稱偽清洗錦劑Tr萬it淡on販X萍-1砌00、酒精叨或某建些消化水酶如胃罵蛋白紅酶、娘胰蛋提白酶肺、膠著原蛋論白酶獄和淀雹粉酶縮慧（di樹as叛ta蛋se）等。這種座廣泛臘的去硬蛋白挺作用惑無疑季可增凈強(qiáng)組批織的過通透鍛性和后核酸駐探針旨的穿夕透性召，提弓高雜鵝交信狹號(hào)，苗但同本時(shí)也盡會(huì)減劉低RN繪A的保攏存和瓶影響生組織羽結(jié)構(gòu)資的形濟(jì)態(tài)，攔因此塔，在吃用量地及孵胳育時(shí)糠間上廈應(yīng)慎漢為掌變握。蛋白且酶K（Pr毫ot炸ei趨na燦seK）:1龜μg裁/m努l(于0.戀1m境ol直/l督T故ri京s/綁50抹mm慚ol很/L截E赤DT文A,矛p與H8約.0緩沖膏液中),銀37幻玉℃孵育15～20光mi另n，以達(dá)次到充蛾分的幕蛋白慢消化概作用決而不妹致影莊響組芳織的霧形態(tài)天為目梨的。蛋白克酶K還具貼有消賴化包宣圍著糠靶DN環(huán)A的蛋巾白質(zhì)沈的作首用，趴從而垃提高吉雜交俯信號(hào)安。在蛋綠白酶K消化巧后，袍應(yīng)用0.陜1m訪ol肌/L的甘氨種酸溶液凳（在PB摸S中）細(xì)清洗煮以終香止蛋死白酶K的消糾化作稍用，花甘氨來酸是乓蛋白結(jié)酶K的抑蠅制劑拋。為唐保持蠟組織沿結(jié)構(gòu)落，通太常用4%多聚艷甲醛簡再固盞定。Bu旗rn夢s等（19旱87）報(bào)抄告應(yīng)踏用胃蛋且白酶（Pe散ps招in）20～10得0μ原g/滅ml（用0.怨1nHC圓l配）37泛℃、30趙mi青n進(jìn)行后消化薯，所身獲實(shí)季驗(yàn)結(jié)切果優(yōu)杜于蛋膏白酶K。多聚朋甲醛鞏固定奪后，鹽浸入乙酸宋酐（ac鞠et社ic置a驢nh誘yd效ri廳de）和三乙賞醇胺（tr銳i－et末ha暖no些la隙mi委ne）中以扎減低戰(zhàn)靜電勸效應(yīng)雜，減需少探元針對(duì)撥組織乏的非初特異所性背話景染爐色。有的史作者瘡除在斃室溫筑下浸產(chǎn)于上算述溶輪液10拋mi恒n外，暗還在脹預(yù)熱37邁℃的50詢%甲酰漏胺/2詞×S膝SC液中預(yù)堂雜交15稠mi啄n，然后縫用2×罵SS僚C，0.但30忘mo僵l/恨l絲式Na贊Ac歌/0們.0臣30聰mo默l/工L枸櫞闖酸鈉紛液中臉浸15練mi忽n。但也有趟報(bào)道效乙酸串酐和朋三乙腔醇胺當(dāng)液的辭處理奶并不請(qǐng)能起皺到減有低背球景的尸目的凝，不脅能改參善IS擱HH的信/噪比砍例。3．減哥低背煙景染喊色雜交爸后（Po饞st罩hy茂br欄id或iz鏟at生io通n）的酶臂處理兔和雜裳交后鴨的洗吧滌均邀有助憶于減劑低背舒景染榴色。預(yù)雜猴交（Pr宿eh們yb窩ri廟di承za日ti以on）是減繪低背伍景染每色的耀一種釘有效溪手段月。預(yù)財(cái)雜交染液和交雜交肌液的舟區(qū)別憑在于塞前者絕不含史探針脆和硫辣酸葡父聚糖補(bǔ)（De獲xt拿ra令nsu雷lp譜ha鏈te）。將組虧織切討片浸戶入預(yù)皇雜交手液中漫可達(dá)激到封效閉非漁特異財(cái)性雜輕交點(diǎn)強(qiáng)的目臉的，攻從而天減低派背景吸染色顆。4．防誕止RN妄A酶的污染由于但在手商指皮子膚及殺實(shí)驗(yàn)險(xiǎn)用玻猜璃器黃皿上善均可較能含澤有RN飼A酶，償為防謀止其裳污染犬影響擊實(shí)驗(yàn)慚結(jié)果喚，在泳整個(gè)趣雜交仔前處避理過替程都鄰需戴先消毒扯手套枕。所叮有實(shí)慈驗(yàn)用侮玻璃朝器皿票及鑷盤子都符應(yīng)于坊實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｇ耙簧蛉罩帽俑邷貍?4拾0℃）烘駕烤以君達(dá)到釘消除RN蓄A(yù)酶的洪目的疏。要破辭壞RN添A酶，吩其最撞低溫斤度必面須在15慢0℃左右冶。雜道交前洗及雜執(zhí)交時(shí)處所應(yīng)斧用的郵溶液船均需咬經(jīng)高濟(jì)壓消觸毒處誼理。（三旗）雜秀交（Hy扎br娘id旨is毒at前io凳n）雜交麥?zhǔn)菍⑺央s交鞋液滴掘于切寨片組洽織上犁，加遇蓋硅德化的險(xiǎn)蓋玻仰片。辰加蓋墳片的春目的遵是防葡止孵獵育過乎程中役的高販溫（50昨℃左右夠）導(dǎo)歷致雜衣交液賊的蒸填發(fā)。脆硅化航的蓋勉玻片略的優(yōu)程點(diǎn)是堡清潔垂無雜假質(zhì)，昆光滑籮不會(huì)免產(chǎn)生悄氣泡啟和影索響組植織切倚片與維雜交助液的柳接觸音，蓋軋玻片揉自身速有一予定重澤量能蚊與有際限的鄭雜交鋒液吸且附達(dá)冶到覆堤蓋和朵防止懲蒸發(fā)耗的作擁用。膛為保輝證雜縱交所皺需的鏟濕潤鞏環(huán)境諷，放說在濕半盒中謎進(jìn)行乞孵育白。注意腸事項(xiàng)1．探針冤的濃畢度很難競事先年確定銳，但貢要掌政握一汽個(gè)原不則，搏即探哪針濃稀度必搭須給戚予該慚實(shí)驗(yàn)懼最大帆的信/噪比司值。非放忽射性私標(biāo)記貝（生轎物素臭或地篇高辛烈）探有針濃愧度為0.胖5～5.萍0μ番g/標(biāo)ml（即0.使5～5.鑼0n耳g/習(xí)μl）。放射耐性標(biāo)攔記的ds瘦DN誰A或cR攝NA探針晨濃度俯在2～5n介g/貓μl。必須綠強(qiáng)調(diào)現(xiàn)的是著，加退雜交牽液的鋼量要牧適當(dāng)廣，以10～20裂μl手/每張眾切片救為宜砌。雜猾交液縫過多若不僅鑒造成暖浪費(fèi)陵，而對(duì)且液懂量過矛多常糖易致葬蓋玻團(tuán)片滑跪動(dòng)脫幅落，符影響臺(tái)雜交鋪效果瞎，過莊量的墳雜交如液含圖核酸煌探針下濃度辮過高加，反欲易導(dǎo)擦致高速背景織染色孫等不僚良后蠢果。2．探針價(jià)的長卻度一般準(zhǔn)應(yīng)用碧于IS打HH探針把的最胸佳長疲度應(yīng)境在50～10底0個(gè)堿飄基之遷間。擁探針危短易徹進(jìn)入浴細(xì)胞肺，雜倆交率汪高，奇雜交也時(shí)間臣短。3．雜恐交的溫度爆和時(shí)姥間原位酷雜交蔥中，得多數(shù)DN用A探針諷需要紐奉的Tm是90恰℃，而RN籠A則需緞要95傍℃。在雜麗交的失程序腿中常垃規(guī)的銳加入30悔%～50棕%甲酰鏟胺（fo衰r－ma羊mi祥de）于雜壟交液跳中。補(bǔ)反應(yīng)笨液中怕每增植加1%的甲輩酰胺輪濃度棗，Tm值可晨降低0.詞72環(huán)℃?？捎帽{(diào)節(jié)膨鹽濃盲度的懂辦法熟來調(diào)揪節(jié)Tm。由于大鹽和起甲酰腸胺濃洽度的驅(qū)調(diào)節(jié)鮮等因撥素，頃實(shí)際肢采用框的原蓬位雜層交的占溫度昨在Tm足-2蜓5℃左右賀，即宅比Tm減低25鮮℃，大陶約在30～60萍℃之間根據(jù)賀探針漿的種妄類不鋒同，犧溫度有略有玩差異下，RN濾A和cR桿NA探針愈一般遠(yuǎn)在37～42縫℃左右海，而DN共A探針踩或細(xì)墳胞內(nèi)雞靶核瞎苷酸俯為DN料A的，請(qǐng)則必孤須在80～95看℃加熱腳使其琴變性夫，時(shí)取間5～15稀mi藝n，然后弱在冰零上擱琴置1m聾in，使之射迅速低冷卻而，以丑防復(fù)航性，籍再置牙入盛淘有2×營SS紹C的溫架盒內(nèi)目，在37～42斬℃孵育蠻雜交臭過夜鍋。從理麻論上芳講，梯核苷賴酸雜甚交的莊有效境反應(yīng)常時(shí)間郵在3h左右積。但朽為穩(wěn)鼠妥起帝見，渡一般攻將雜昨交反危應(yīng)時(shí)逮間定凡為16～20吉h。當(dāng)然院，雜稼交反以應(yīng)的挽時(shí)間蜘與核櫻酸探扛針長姐度與介組織獸通透幟性有受關(guān)。有作淚者主議張雜聽交反縮慧應(yīng)的徹孵育界應(yīng)在掠黑暗頁環(huán)境破中進(jìn)公行，欣因?yàn)樽瞎饩€習(xí)會(huì)促鄭進(jìn)甲士酰胺風(fēng)的電焦離作醉用。4．雜請(qǐng)交嚴(yán)混格度犬（Hy毛br食id兼iz虛at洲io怒n玩st咬ri姻ng止en黨cy）雜交漲條件甲的嚴(yán)爛格度害（st窮ri挎ng系en尺cy）表示籃通過氣雜交減及沖聽洗條樓件的蠅選擇劉對(duì)完?duì)N全配琴對(duì)及緊不完攪全配攻對(duì)雜乓交體潔的鑒闖別程碑度。線錯(cuò)配艙對(duì)(m荒is塞ma乎tc誘h）雜交鼠的穩(wěn)糾定性咬較完孔全配轎對(duì)雜刺交體尼差，錄因此敲，通聲過控鵝制雜蟻交溫朋度、勻鹽濃賓度等飾，可韻減弱論非特視異性鐮雜交劃體的牙形成借，提截高雜博交的慌特異飽性。雜交檔的條喇件愈顏高，冶特異忌性愈凱強(qiáng)，姓但敏顫感性俊降低嗓。一扇般來怒說，低嚴(yán)討格度（lo稱w昨st鵝ri掙ng羞en怕cy）雜交凈及沖攔洗條蓄件在Tm拋-起35慈℃至Tm尼–插40性℃之間尼，高禿鹽或憑低甲菊酰胺單濃度積。在男這種處條件睛下，驢大約成有70進(jìn)%～90叮%的同品源性肅核苷使酸序劣列被趴結(jié)合憂，其鼓結(jié)果乒是導(dǎo)干致非鴉特異躲性雜巾交信逆號(hào)的偶產(chǎn)生懂。中嚴(yán)聲格度，Tm鉤-遼20因℃至Tm修-3秤0℃的范包圍。高嚴(yán)暑格度（hi床gh間s病tr臘in序ge衰nc律y）為Tm透-1槐0℃至Tm渣-1訂5℃，低鹽魂和高氣甲酰政胺濃勒度。束在這發(fā)種條撫件下宜，只答有具香有高賴同源子性的育核苷叔酸序訊列才樓能形子成穩(wěn)遙定的品結(jié)合拉。由于私原位臟雜交川技術(shù)疏多數(shù)貞是在Tm騎-2悶5℃進(jìn)行秀的，悅不屬咬于高唐嚴(yán)格蝦范圍虹，無壺疑會(huì)潔產(chǎn)生勇非特潔異性結(jié)結(jié)合塞導(dǎo)致蓮信/噪比充減低薦。在短這種盯情況鳳下，倒可用外加強(qiáng)潑雜交站后處囑理洗關(guān)滌的努嚴(yán)格毀度使巡壽非特峰異性厲的雜許交體扣減少彎。由餐于RN妹A雜交催的穩(wěn)倒定性帝，應(yīng)仍用cR山NA探針命進(jìn)行爪細(xì)胞確或組展織的毒原位拐雜交卸時(shí)的拐雜交浩溫度鄉(xiāng)豐比其下它核歸酸探見針要桃高10～15姐℃。實(shí)洞驗(yàn)證要明，cR陷NA產(chǎn)生晚的信破號(hào)比釣雙鏈cD黨NA要強(qiáng)濃。單錫鏈的RN疑A探針忠其雜玩交信脾號(hào)大凍于雙搶鏈的cD梢NA的約8倍。5．硫蘋酸葡遣聚糖矛（De優(yōu)xt害ra腫nsu其lp鏡ha爹te）和甲泊酰胺守（fo言rm欲am摔id惰e）硫酸洲葡聚邁糖是古核酸免雜交莫液中爹僅次昌于甲煤酰胺財(cái)?shù)囊黄欠N組察成成和份。協(xié)在雜累交液攝中，奴甲酰象胺占50鞭%左右密，而歲硫酸壟葡聚像糖占10移%左右買。它綱具有儀極強(qiáng)團(tuán)的水稻合（hy礦dr臉at暢e）作用底，能因大大曾增加罩雜交擠液的隊(duì)粘稠媽度。僚硫酸珠葡聚客糖的豪主要皇作用漿是促鍬進(jìn)雜蘆交率繪，特?fù)e是罷對(duì)雙賞鏈核姻酸探靈針。矛這是枯應(yīng)用普硫酸軌葡聚塑糖于脾雜交弄液中墊的主姐要目陽的。甲酰薦胺的滴主要狡作用犬在調(diào)雹節(jié)雜垮交反提應(yīng)溫節(jié)度方捆面，老從而賤有助重于保卸持組宣織的姜形態(tài)霧結(jié)構(gòu)董。甲粉酰胺寇還可輛防止盯在低真溫時(shí)絲式非同丹源性洗片段嫩的結(jié)恨合，畫但甲頸酰胺贊具有纖破壞挪氫鍵跳的作癥用從持而具湊有一陡種不必穩(wěn)定襖的作富用。（四鹽）雜靜交后仙處理秩（po段sthy揭br查id百is華at研io磨ntr巴ea咳tm懂en泛t）雜交吃后處感理包糕括系夕列不鼓同濃篇度，嗎不同真溫度叮的鹽奇溶液作的漂去洗。通過族雜交基后的規(guī)洗滌鐵有效邪地減播低背哪景染或色，兩獲得聰較好讓的反儲(chǔ)差效勢果。在雜裹交后漿漂洗僻中的RN傷A酶液怨洗滌嬌能將浸組織寨切片站中非應(yīng)堿基犧配對(duì)RN扇A除去保。洗滌臂的條翻件如掏鹽溶泰液的戀濃度們、溫悲度、屑洗滌陪次數(shù)咱和時(shí)沃間因階核酸挪探針制的類叫型和姻標(biāo)記閘的種團(tuán)類不去同而矩略有纖差異旁，一訂般遵辜循的助共同仇原則拖是鹽爛溶液射濃度讀由高賤到低椒而溫伏度由害低到載高。必須厲注意腐的是功在漂疏洗的裕過程瞞中，獅切勿們使切竄片干肌燥。（五鳥）顯甘示（Vi形su訂al鐘iz怖at奸io值n）顯示總又可肯稱為錯(cuò)檢測顧系統(tǒng)姜（De搖te微ct欣io裳n則sy昨st紋em）。根據(jù)謙核酸抓探針絕標(biāo)記千物的境種類腳分別跳進(jìn)行廳放射澇自顯污影或吧利用填酶檢悉測系顛統(tǒng)進(jìn)考行不警同顯搶色處勁理。細(xì)胞暈或組雁織的晚原位楊雜交桐切片握在顯罪示后柏均可脹進(jìn)行端半定噴量的干測定起，如炸放射領(lǐng)自顯美影可尺利用笨人工懼或計(jì)蟻算機(jī)疾輔助挨的圖餅象分意析檢池測儀田（co鵝mp倉ut追er蒸–常a午ss粉is器te鉆d山im餓ag酒e茂an尤al省ys糟is）檢測弱銀粒算的數(shù)略量和揚(yáng)分布平的差篩異。箱非放耗射性峽核酸令探針膏雜交板的細(xì)見胞或?qū)ЫM織晴可利維用酶盒檢測魄系統(tǒng)柱顯色或，然匪后利首用顯屠微分圣光光景度計(jì)遠(yuǎn)或圖碼像分貌析儀替對(duì)不岸同類總型和制數(shù)量墊的核漫酸的翠顯色拌強(qiáng)度屯進(jìn)行之檢測輔。（六舉）對(duì)戒照實(shí)喊驗(yàn)和IS夏HH結(jié)果就的判摩斷和其際它實(shí)極驗(yàn)方楚法一虜樣，像并非IS狠HH的任垂何陽望性信脆號(hào)都如是特檔異性校的，使故必旁須同斥時(shí)有剝對(duì)照耐試驗(yàn)除以證雜明其忠特異喬性。言對(duì)照立試驗(yàn)廚的設(shè)稻置須駐根據(jù)鑄核酸哲探針耕和靶杜核苷蘋酸的屠種類結(jié)和現(xiàn)姨有的狗可能租條件久去選滴定，榴常用綱的對(duì)酬照試揚(yáng)驗(yàn)有銜下列萌幾種IS滅HH對(duì)照朽試驗(yàn)御一覽厲表核乳奮膠或貧非放扇射性國檢測動(dòng)系統(tǒng)俯對(duì)照呈試驗(yàn)No崖rt乏he情rn或So鋼ut簽he蜻rn印跡互雜交宅法IS迅HH與免細(xì)疫細(xì)污胞化譜學(xué)結(jié)摧合應(yīng)用慈多種矩不同夫的核遣苷酸纖探針金與同折一靶章核酸糞進(jìn)行擦雜交將cD咳NA或cR沖NA探針寒進(jìn)行捐預(yù)雜登交（飄吸收暈試驗(yàn)?zāi)ィ┡c非庭特異豈性（鴉載體鐮）序悟列和座不相副關(guān)探籌針雜勞交（妥置換盡試驗(yàn)蘿）將切羅片應(yīng)勢用RN愛A酶或DN展A酶進(jìn)晃行預(yù)拳處理晃后雜停交應(yīng)用烏同義RN們A探針覺（Se歐ns洲e望pr周ob鐮e）進(jìn)行狼雜交以不酷加核孝酸探斃針雜眼交液敢進(jìn)行料雜交滲（空棄白試動(dòng)驗(yàn)）組織引對(duì)照蠢用已奧知確匙定為坊陽性宣或陰鏡性組膊織進(jìn)汗行IS劉HH對(duì)照應(yīng)用糊未標(biāo)間記探璃針做IS濕HH，進(jìn)行抵對(duì)照從理荒論上廊講，盜對(duì)照毅試驗(yàn)猴設(shè)置獵愈多耍其靶泳核苷饒酸特督異性揭確定性愈可爽靠，宋但現(xiàn)釘實(shí)是輝不可菜能的鎖。因潤此，井在上毯述對(duì)蠢照試渡驗(yàn)中栗應(yīng)任年選設(shè)潔至少3～4種用伐以證清實(shí)IS苗HH結(jié)果諷的可印靠性犧。比較跪可靠進(jìn)的對(duì)名照試踐驗(yàn):No遠(yuǎn)rt拾he黑rn和So垂ut法he縮慧rn印跡好雜交繞法。用結(jié)遍合的薄免疫庭組織翅化學(xué)另和IS鴨HH法從穴蛋白圣質(zhì)（憶或多哨肽）效水平鍬和轉(zhuǎn)牙錄水喊平在團(tuán)相鄰障切片粉或同畫一切碼片中寸證明們同一項(xiàng)種多岡肽和島相應(yīng)mR橫NA共存狡于同籃一細(xì)酒胞中揉。預(yù)先憶將切奶片用DN淋A酶或RN比A酶消擱化，等然后召用IS軋HH技術(shù)兇證明墾丟失限的是DN鏈A或RN甲A。如同佳免疫抵組化廊的吸林收試旺驗(yàn)一導(dǎo)樣，撤事先紙與特驅(qū)異性老的cR匯NA或cD宵NA進(jìn)行嚷雜交示。再某進(jìn)行IS菌HH，其結(jié)庸果應(yīng)亂為陰沖性。由于法同義RN趕A探針造和組裙織內(nèi)mR描NA序列雖順序勞是相致同的堂，應(yīng)斧用其耀進(jìn)行IS廚HH，結(jié)果撕應(yīng)為管陰性物。檢測拘系統(tǒng)竟的對(duì)預(yù)照如塑乳膠輔或酶憐顯色翅系統(tǒng)效也應(yīng)莊在無菜標(biāo)記染探針吹的情捆況下浩進(jìn)行抓。IS訊HH的最書大優(yōu)妖點(diǎn)是鐵它的套高度鉆特異遲性，摸它可畫測定誕組織慎、培尚養(yǎng)的醒單個(gè)蔑細(xì)胞穗或細(xì)碰胞提泡取物突中的漂核苷日酸含鴉量。應(yīng)用航高敏照感度展的放握射性傻標(biāo)記cR敏NA探針姓在理摧想的IS謊HH的實(shí)版驗(yàn)條樸件下厲檢測mR抽NA，其敏亦感度拌可達(dá)枯到20個(gè)mR議NA拷貝/每個(gè)奧細(xì)胞亡。由于飾雙鏈DN純A的穩(wěn)弄定性溝，在穩(wěn)用IS脈HH定位DN虧A時(shí)很舍少發(fā)蠢生丟向失，懇降解油。在反靶核壯苷酸潤序列洋比較皆伸展尺的情謠況如虎染色甩體鋪坊片，絡(luò)長于2k賴b的探絕針可姿以應(yīng)概用。飾因此落，其佛敏感他性高婦到能褲夠出彎在染羞色體羅鋪片支上，斬有時(shí)唇甚至視在組縣織切吩片上橋的單測個(gè)基虎因拷影貝。正因稍為如躬此，圓對(duì)IS悄HH結(jié)果港的解頭釋應(yīng)聯(lián)持慎倍重態(tài)春度，襲特別俱是前墳人未肚報(bào)告夜過的抗新發(fā)警現(xiàn)。因?yàn)槭叭缜皡査瞿?，影偶響IS賠HH實(shí)驗(yàn)蝕結(jié)果右的因篩素太譜多，衛(wèi)比如洪在外年科或揀實(shí)驗(yàn)屈取材肢后未芹及時(shí)鄉(xiāng)豐的固表定或深冷凍腫可由瓣于組謠織中mR寬NA的降怨解而電導(dǎo)致該假陰稍性結(jié)彎果。另外億，在究各種塌類型弓核酸尸探針望進(jìn)入枝細(xì)胞筒、組么織和朱各種傳器官禾的能堅(jiān)力，虧又叫籍可接錄近性問（ac龍es閉si杰bl光it雞y）各異莊。這鄭些諸陽多因異素都俯將影硬響IS愿HH的實(shí)蹤蝶驗(yàn)結(jié)附果。1、使壓用地高圾辛標(biāo)記辯的核酸改探針進(jìn)行石蠟紗切片的RN掘A原位蟻雜交第一投天1）次二甲戴苯于37圾℃脫蠟2次，規(guī)每次15分鐘扇；2）笛無水佛乙醇席浸泡2次，露每次3分鐘神；3）95隸%乙醇炭浸泡2次，鏟每次3分鐘掌；4）PB帖S清洗3分鐘梅；5）2%焦碳銀酸二占乙酯勤室溫杜下浸搬泡10分鐘俯；6）PB咬S清洗10分鐘盟；7）箭加入勒胃蛋竄白酶25榆ul咳/m朗l，37岡℃孵育15分鐘近；8）PB西S清洗2次，采每次3分鐘加；9）0.軟2N的HC迫l孵育30分鐘增；10）PB躁S清洗2次，薄每次3分鐘構(gòu)；11）0.租25譽(yù)%無水星乙酸音和0.遇1M三乙扔醇胺種孵育10分鐘時(shí)；12）PB萌S清洗2次，勇每次5分鐘騙；13）預(yù)色雜交討緩沖裁液孵砍育30分鐘證；14）準(zhǔn)咱備核守酸探匆針混握合物肆：使辮用預(yù)插雜交合緩沖福液稀演釋探旨針，85卻℃加熱5分鐘歡，置構(gòu)于冰隱塊中10分鐘倉；原位臟雜交繩操作流程15）雜掠交；沙第二宵天16）將婚玻片捧置于SS睛C中2次，阿每次5分鐘憲以去劈燕除封夕片；17）PB曲S清洗3分鐘啟；18）RN廢A酶溶液牧中（菊或0.詞1-見1n料g/歷ml芝PB頑S中）伸，37樓℃孵育30分鐘躁；19）PB偽S清洗5分鐘看；20）室缺溫，2×誰SS鼓C清洗10分鐘凳；21）37秧℃，1×貍SS后C清洗10分鐘戰(zhàn)；22）37肢℃，0.輝5×句SS蒸C清洗10分鐘捧；23）緩鎮(zhèn)沖液炒孵育10分鐘卸；24）緩邁沖液（1%正常福綿羊狂血清序和0.著03警%T憂ri屠to聾n垮X-祖10級(jí)0）孵育30分鐘他；25）加轉(zhuǎn)入抗暈地高唯辛抗只體，37腹℃孵育3小時(shí)念；26）緩郊沖液困清洗2次，蛾每次10分鐘妥；27）緩孫沖液厚清洗2次，搞每次5分鐘壺；28）制開成NB族T/剃BC撿IP暗處年保存30慘-6飯0分鐘衛(wèi)，顯迫微鏡狡下進(jìn)虜行觀展察，禿如果藍(lán)背景燦尚佳漠，顯才色時(shí)柔間可課延長續(xù)到16小時(shí)趙；29）停鞋止緩賭沖液領(lǐng)的反倡應(yīng)，音用水括進(jìn)行召簡單塞的清絕洗；30）固半紅，轎脫水露以及處封片普進(jìn)行巾核的震復(fù)染誦。2、使井用地高草辛標(biāo)記條的寡核余苷酸紗探針進(jìn)行石蠟暴切片的原位DN矛A雜交第一屬天1）濱二甲創(chuàng)苯于37段℃脫蠟2次，織每次15分鐘拾；2）箭無水錯(cuò)乙醇益浸泡2次，胸每次5分鐘熄；3）95郊%乙醇蒜浸泡2次，