基因工程實驗第1頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程實驗周景文江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工研究室10July2023第2頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月概述PCRDNA/RNA的凝膠電泳質(zhì)粒提取基因組提取常用工具酶怎樣把一個基因連接到質(zhì)粒上？怎樣把幾個片段連接到一起？基因敲除過量表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)常用軟件常用網(wǎng)址常用供應(yīng)商第3頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月1.PCR酶的選擇：普通的DNA聚合酶：Taq

末端有A尾，可以直接用于TA克隆，連接到T載體上；高保真的DNA聚合酶：Pfu(Pyrobest)

末端無A尾，無法直接連接至T載體上。反應(yīng)條件的選擇：Mg2+:過低反應(yīng)無法進行，過高易產(chǎn)生錯配；Mn2+:使錯配率增加，用于易錯PCR，進行定向進化。第4頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月特殊的PCR：融合PCR(與SOE-PCR原理一致)：見文獻：Shevchuk,N.A.,A.V.Bryksin,etal.(2004)."ConstructionoflongDNAmoleculesusinglongPCR-basedfusionofseveralfragmentssimultaneously."NucleicAcidsRes

32(2):12.Szewczyk,E.,T.Nayak,etal.(2006)."FusionPCRandgenetargetinginAspergillusnidulans."Nat.Protoc.

1(6):3111-3120.2.巢式PCR

目前已經(jīng)較少用到。3.易錯PCR(Error-PronePCR)

用于隨機突變。通過控制Mg2+和Mn2+的濃度實現(xiàn)。第5頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2.DNA/RNA凝膠電泳電泳基質(zhì)主要分為瓊脂糖和聚丙烯酰胺兩類平常我們主要用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖濃度的選擇一般按下表，1%的瓊脂糖最為常用，可以分離分子生物學(xué)操作中常見的片段大小。瓊脂糖濃度/％0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb60~520~110~0.87~0.56~0.44~0.23~0.1瓊脂糖濃度與DNA分離范圍Marker的大小應(yīng)根據(jù)預(yù)計片段的大小進行選擇質(zhì)粒或其它環(huán)狀DNA的大小不能根據(jù)Marker進行判斷！第6頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月3.質(zhì)粒提取細菌：堿裂解法；試劑盒；破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。酵母酶破壁+堿裂解法；試劑盒；破壁一般采用Lyticase(有的公司稱為Zymolyase)或玻璃珠法；后續(xù)步驟基本相同。第7頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月4.基因組提取細菌：試劑盒；破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。酵母試劑盒；破壁一般采用Lyticase(有的公司稱為Zymolyase)或玻璃珠法；后續(xù)步驟基本相同。第8頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月5.常用工具酶基因工程中常用到的工具酶包括：Lysozyme/溶菌酶：用于酵母和植物破壁用的裂解酶；Lyticase：用于酵母和植物破壁用的裂解酶；RNA酶：用于降解提取DNA中的RNA；DNA酶（DNA外切酶）：用于去除RNA或蛋白質(zhì)樣品中的DNA；DNA聚合酶：用于PCR，常用Taq和Pfu；反轉(zhuǎn)錄酶：用于從mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；各種限制性內(nèi)切酶；連接酶；堿性磷酸酶：用于連接前處理，常用CIAP（小牛腸堿性磷酸酶）；共性：除RNA酶和Taq/Pfu之外，基本上都對熱不穩(wěn)定，需要在-20C保存，使用時也需要盡量放置冰上！第9頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1限制性內(nèi)切酶定義：限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）:識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。[單位定義]：在指明pH與37℃，在0.05mL反應(yīng)混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。詳見：/view/48578.htm最常用的內(nèi)切酶：BamHI、EcoRI和HindIII價格最便宜，最容易切開，最容易連上！如果有可能，盡可能優(yōu)先考慮這3種內(nèi)切酶。第10頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2連接酶定義：又稱合成酶，能催化兩個分子連接成一個分子或把一個分子的首尾相連接的酶。此反應(yīng)與ATP的分解反應(yīng)相偶聯(lián)。在把兩分子相連接的同時發(fā)生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸鍵的斷裂如DNA連接酶等。在基因操作中，特指能將兩個片段通過粘性末端或平末端連接起來的一類酶。通常用于將DNA片段連接到質(zhì)粒上。目前主要用的是一種來源于T4噬菌體的連接酶，通常稱為“T4DNA連接酶”。第11頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月6.怎樣把一個基因連接到質(zhì)粒上？Taq，ExTaq，LA-Taq的PCR產(chǎn)物，直接連接至T載體上；各家公司對T載體的命名方式不一樣，需要仔細查看相關(guān)的說明文件。設(shè)計了酶切位點的PCR產(chǎn)物：單酶切后插入經(jīng)過相應(yīng)酶切后的載體上；

此處需要用堿性磷酸酶處理酶切后的載體，一般用CIAP；雙酶切后插入經(jīng)過相應(yīng)酶切后的載體上；

原則上需要用堿性磷酸酶處理酶切后的載體，但雙酶切中基本上忽略，但對于一些酶切效率較低的酶，最好處理載體；通過同源重組連接入載體：在PCR引物兩端設(shè)計與酶切后載體同源的序列(15-20bp)，通過同源重組酶連接至載體上(Invitrogen稱為Topo克隆，Gateway克隆)。第12頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月7.怎樣把幾個片段連接到一起？酶切連接：設(shè)計多個不同的酶切位點，將相應(yīng)的PCR片段用酶切的方法一段一段的連入載體中，最后再用兩端的引物進行PCR，得到最終所需的片段融合PCR/重疊延伸PCR片段兩端與需要連接的片段有15–20bp的同源序列；用高保真酶先得到待連接的片段；以等摩爾的待連接片段為模板，用兩端的引物進行PCR，可以得到連接后的PCR片段。第13頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月8.基因敲除目的：將一個基因替換為了一個標記基因，或通過其它表型進行篩選步驟：構(gòu)建敲除框轉(zhuǎn)化篩選鑒定第14頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月8.1構(gòu)建敲除框酶切連接：將待敲除片段及兩端序列PCR后插入T載體中，選擇合適的酶切位點，插入標記基因；將待敲除片段的左端和右端及抗性基因分別進行PCR，得到三段引物，用酶連法順序連接至載體中；融合PCR；將待敲除片段的左端和右端及抗性基因分別進行PCR，得到三段引物，用酶連法順序連接至載體中；長引物PCR；在引物末端設(shè)計長的同源片段，擴增得到標記基因后，直接用于轉(zhuǎn)化。第15頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月8.2轉(zhuǎn)化化學(xué)轉(zhuǎn)化法：原核微生物：氯化鈣法、Inoue法等；酵母：鋰鹽法。電轉(zhuǎn)化法：原核微生物：甘露醇法；酵母：山梨醇法；鋰鹽+DTT預(yù)處理+山梨醇法。基因槍法：將待轉(zhuǎn)化的核酸片段包被于金屬顆粒上，直接用于轉(zhuǎn)化。脂質(zhì)體法：用于動植物細胞的轉(zhuǎn)化，偶爾用于酵母轉(zhuǎn)化。第16頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月8.3篩選根據(jù)抗生素抗性：原核微生物：氨芐抗性、卡那抗性等；酵母：G418、Zeocin、博萊霉素等。根據(jù)營養(yǎng)缺陷型回復(fù)：酵母：尿嘧啶、亮氨酸、腺嘌呤缺陷型回復(fù)。第17頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月8.4鑒定提取基因組，進行PCR驗證；基因功能缺失的表型驗證；Southern雜交；Northern雜交；Western雜交。第18頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月基因敲除實例-以LEU2作為篩選標記敲除釀酒酵母ACS2基因乙酰輔酶A(acetyl-CoA)是細胞內(nèi)重要的輔因子，參與微生物細胞眾多的生化反應(yīng)。細胞內(nèi)的乙酰輔酶A合成酶有兩個同工酶，分別由ACS1和ACS2編碼，在釀酒酵母中的主要合成途徑為丙酮酸脫氫酶支路。如下圖所示。第19頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2.將經(jīng)過PCR反應(yīng)所得的目標片斷連接到T載體(藍白斑篩選)使用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0

設(shè)計ACS2基因合成所需的PCR反應(yīng)的引物。ACS2-F：5’-GCgaattcATGACAATCAAGGAACATA-3’ACS2-R：5’-GCaagcttTTATTTCTTTTTTTGAGAGA-3’從NCBI上得到的ACS1/2基因序列第20頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月3.使用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0設(shè)計KlLEU2引物，并以pUG73作為模板進行PCR反應(yīng)。(該引物兩端均帶有NcoI的酶切位點和若干保護堿基)4.使用NcoI限制性內(nèi)切酶分別處理步驟2，3所得的目標產(chǎn)物，并進行連接反應(yīng)。將KlLEU2片斷連接到T載體上。第21頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月5.以連接后所得的T載體作為模板，ACS2-F，ACS2-R為引物進行PCR反應(yīng)，得到如下圖所示長片斷。6.將該長片斷電轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，用亮氨酸缺陷型回復(fù)作為標記篩選陽性克隆子。7.將不含有亮氨酸的培養(yǎng)基上長出的單菌落提基因組進行PCR（以ACS2-F，ACS2-R為引物）。進一步驗證排除假陽性。第22頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月9.過量表達整合表達常見于畢赤酵母(Pichiapastoris)中，利用pPIC系列整合載體，將要表達的片段整合到染色體上；在釀酒酵母中，也可以利用YIP系列整合載體(載體名稱可能有所不同)，將要表達的片段整合到染色體上特點：整合的轉(zhuǎn)化子同源重組效率較低不易篩選，可能對基因組產(chǎn)生潛在的破壞作用，單拷貝，穩(wěn)定。質(zhì)粒載體表達：用于各種真核和原核表達體系中，將待表達的片段置于合適的啟動子和終止子之間，如果有必要的話，還需要加上適當?shù)男盘栯男蛄?如分泌表達，或定位于亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)時)，連接到合適的表達載體中。再將整個載體轉(zhuǎn)入宿主細胞中。特點：容易操作，高拷貝，無選擇壓力時不穩(wěn)定。第23頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月基因過量表達實例-釀酒酵母ACS1/2基因的過量表達利用PrimerPremier5.0設(shè)計ACS1/2基因的引物，并添加圖上所示的酶切為點，經(jīng)過PCR，酶切，連接，轉(zhuǎn)化后得到表達載體第24頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月表達載體導(dǎo)入受體細胞進行目標基因的過量表達3D(ura)pY263D(ura)pY26-ACS13D(ura)pY26-ACS2經(jīng)過電擊或者化學(xué)轉(zhuǎn)化后，釀酒酵母在不含有URA3的平板上長出單菌落。第25頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月隨著發(fā)酵的進行細胞內(nèi)乙酰輔酶A含量的變化情況第26頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月10.質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體，通常分為兩類：克隆載體表達載體按在目標菌株中的拷貝數(shù)分類：高拷貝質(zhì)粒載體——幾乎所有的克隆載體都是高拷貝的，易于提取和進行后續(xù)基因操作，如：

pUC系列載體，pBlueScript系列載體，pY系列載體；低拷貝質(zhì)粒載體——為了防止拷貝數(shù)過高對宿主細菌產(chǎn)生不利影響，一般是表達載體，如：

pET系列載體，pRS系列載體。第27頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月用于基因工程操作的質(zhì)粒一般具有以下特性：復(fù)制起點

如果是穿梭載體(Shuttlevector)，還需要具有不同菌株的復(fù)制起點，如酵母穿梭載體中的2m片段和相應(yīng)菌株的CEN-ARS片段?？剐詷擞浂嗫寺∥稽c(MCS,Multi-CloningSite)為了表達位于其上的基因，一般還需要具有：合適的啟動子合適的信號肽序列(可選)相應(yīng)的終止子為了便于對連接上的基因進行鑒定，通常還有測序引物結(jié)合位點：T7，M3……第28頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月抗性基因抗性基因復(fù)制起點早期的pBR322載體，整個載體用酶連形成的第29頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月多克隆位點(用于連接外源基因)復(fù)制起點基于pBR322的pUC19載體，可以用藍白斑篩選抗性基因用于藍白斑篩選的lacZ基因測序引物結(jié)合位點第30頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于藍白斑篩選pUC19和其它pUC系列載體(包括Takara的T載體)上的lacZ基因經(jīng)過改造，引入了一系列酶切位點。當酶切位點中未插入其它基因時，加入半乳糖類似物IPTG后，lacZ基因開始表達，并可以催化X-Gal，使菌落呈藍色；當酶切位點插入其它基因時，lacZ基因被破壞，菌落為白色。第31頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月多克隆位點(用于連接外源基因)復(fù)制起點大腸桿菌中的表達載體pET-28a(+)抗性基因HisTag第32頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于HisTagHisTag是一串編碼組氨酸的序列，使得表達的產(chǎn)物的末端帶有6個組氨酸，這6個組氨酸可以形成特定的構(gòu)向，可以用于：目標蛋白的快速純化：可以用鎳柱進行快速分離；簡單的Western雜交：可以與HisTag抗體進行雜交，進行快速的鑒定或定量。類似的還有Thrombin，HemagglutininTag等，常見于各種表達載體中，方便表達產(chǎn)物蛋白的純化。第33頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月啟動子氨芐抗性多克隆位點酵母中的篩選標記2mum片段酵母中的復(fù)制起點終止子釀酒酵母中的表達載體pYX212第34頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌中常用的啟動子組成型啟動子：T7……一般是來源于噬菌體的強啟動子，不需要誘導(dǎo)即可實現(xiàn)高效表達缺點：無法實現(xiàn)可控表達誘導(dǎo)型啟動子：lacZ……半乳糖或IPTG誘導(dǎo)缺點：葡萄糖抑制，半乳糖和IPTG價格昂貴，無法用于實際生產(chǎn)和大規(guī)模的實驗熱誘導(dǎo)啟動子冷誘導(dǎo)啟動子……第35頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母中常用的啟動子組成型啟動子：TPI，GPD，TEF，ACT……一般是各種中心代謝途徑中的酶或細胞骨架的啟動子，不需要誘導(dǎo)即可實現(xiàn)高效表達缺點：無法實現(xiàn)可控表達誘導(dǎo)型啟動子：GAL1，GAL4，GAL10……半乳糖誘導(dǎo)缺點：葡萄糖抑制，半乳糖價格昂貴，無法用于實際生產(chǎn)和大規(guī)模的實驗METn系列啟動子半胱氨酸抑制CUPn啟動子銅誘導(dǎo)第36頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月11.常用軟件VectorNTIAdvance11序列管理與質(zhì)粒作圖PrimerPremier5.0+Oligo6.71引物設(shè)計與質(zhì)量評估QuantityOne凝膠電泳圖像處理AdobeIllustratorCS4+AdobePhotoshopCS4電泳圖像后處理與示意圖以上軟件均須熟練掌握！第37頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月12.常用網(wǎng)址NCBI