PCR-SSCP技術(shù)和直接技術(shù)對影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的BMPR-IB基因和ADAMTS-1遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，并利用生物信息學(xué)分析法對綿羊的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行相關(guān)聯(lián)分析；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對ADAMTS-1在綿羊不同組織進(jìn)行表達(dá)量分析，對于影響繁殖力候選ADAMTS-1在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行1綿羊BMPR-IB編碼區(qū)864位點(diǎn)多態(tài)性及產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)分試驗(yàn)羊品種出現(xiàn)三種型AAABBB，該編碼區(qū)第846位點(diǎn)發(fā)生C>T高山細(xì)毛羊母羊AB型頻率略高于AA型四種綿羊的優(yōu)勢等位均為A。小尾寒羊、高山細(xì)毛羊、湖羊三種綿羊χ2值和G2值均未達(dá)到顯著水平(p>0.05),而羊的χ2值和G2值達(dá)到顯著水平(P<0.05)，說明除了羊95%PIC多態(tài)信息含量可知，屬于低度多態(tài)的是小尾寒羊和湖羊(PIC<0.25)，而在羊和高山細(xì)毛羊信息含量處于中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5)。顯著性檢驗(yàn)分析表明：，山細(xì)毛羊與小尾寒羊、湖羊羊與小尾寒羊、湖羊中差異呈現(xiàn)顯著(P<0.05)。BMPR-IB編碼區(qū)第846位點(diǎn)突變在不同繁殖力母羊群體中分布不同，該位，2綿羊BMPR-IB3′部分非編碼區(qū)多態(tài)性及產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)分3413′部分非編碼區(qū)擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)第511位點(diǎn)雜合C>T在CG型中非編碼區(qū)544位點(diǎn)雜合C>G，發(fā)現(xiàn)三種型CC、CT、CG。群體中不同型對于產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著，而CT型對于高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔標(biāo)3綿羊ADAMTS-1在不同組織間差異表達(dá)及第五外顯子多態(tài)性分綿羊8個(gè)組織進(jìn)行表達(dá)量分析可知，所有群體的表達(dá)量顯著高于其他組下丘腦。發(fā)現(xiàn)小尾寒羊多羔的表達(dá)量是羊雙羔母羊的1.54倍、羊單羔母羊的2.61倍。通過對ADAMTS-1第五外顯子分析可知，在編碼區(qū)出現(xiàn)C1506T、G1509A，均屬于同義突變，三種帶型分別命名為AA、AB、AC，顯著性分析可知三種型均對產(chǎn)羔數(shù)不顯著。所有綿羊群體χ2檢驗(yàn)表明均處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，PIC值屬于低度中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5)。所得數(shù)據(jù)表明ADAMTS-1對于羊和小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)有重要的影響，初步認(rèn)定是羊和小尾寒羊的多胎主效。綿羊；BMPR-IB；ADAMTS-1；產(chǎn)羔數(shù)；PCR-SSCPThelittersizeofsheepisanimportanteconomiccharacterwhichcandeterminethebenefitofraisingsheep.Butthelittersizeisakindoflowheritabilitythresholdtrait,theconventionalbreedingmethodsgeneticimprovementprogresshasbeenslow.AtpresentThenewtypebiotechnology,especially,molecularmarkershasasignificanteffectonearlyselectionofsheep,whichimprovetheefficiencyandaccuracyofselection.ThisexperimentusingPCR-SSCPanddirectsequencingofBMPR-IBgeneandADAMTS-1genegeneticpolymorphismysisoftheeffectoffecundityofsheep,Andysisoflittersizeinsheepwereassociatedwithbiologicalinformationysis,TheexpressionofADAMTS-1geneindifferenttissuesofsheepwasyzedbyreal-timefluorescent tativetechnique,andtheeffectofADAMTS-1geneonthetranscriptionlevelwasverified.Inordertoprovidetheoreticalbasisforimprovingthefecundityofsheep.Resultsareas1ysisofPolymorphismat864LocusofBMPR-IBGeneCDSRegionandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreedsTheresultsshowedthattherewerethreekindsofgenotypeAA,ABandBBintestedsheepbreeds,andC→Tmutationoccurredincodingregionof846.AAwasthedominantgenotypeinSmallTailHanewesandHuewes,whileABwasthedominantgenotypeinMongoliaewesandGansualpinemerinoews.Awasthedominantallelesinallfoursheepsamples.Theχ2andG2valuesofSmallTailHanewes,GansualpinemerinoewesandHuewesdidnotreachedthesignificantlevel(p>0.05),buttheχ2andG2valuesofMongoliaewesreachedthesignificantlevel(P<0.05),whichindicatedthatthreeotherewesallfittedwithHardy-WeinbergequilibriumexceptMongoliaewes.TheobservedvalueFoffoursheepbreedsinBMPR-IBgenewereinthe95%confidenceinterval,andclosertotheon-line.AccordingtothePICamongdifferentbreedswecouldgetthatSmallTailHansheepandHusheepbelongtolowpolymorphism(PIC<0.25),whileMongoliasheepandGansualpinemerinosheepbelongtomoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).SignificanttestshowedthatGansualpinemerinosheephadsignificantdifferenceswithSmallTailHansheepandHusheep,andMongoliasheephadsignificantdifferenceswiththeotherthreesheepbreeds(P<0.05).Themutationoccurredin846siteinBMPR-IBgenecodingregiondistributeddifferentlyinewegroupswithdifferentfecundity,whichmeantthatthislocuscouldbeconsideredasapotentialmolecularmarkerinsheep.2ysisofPolymorphismatPartial3′UTRBMPR-IBGeneandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreeds341sheepinthreesheepbreedstotal,usingpolymorphismdetectionin3sheep'partofthenonencodingregionwasamplified,511heterozygousC>TinCGgenotype,544heterozygousnonencodingregionofC>G,foundthreegenotypesofCC,CT,CG.InAlpineMerinoewesgroup,CTgenotypehasasignificanteffectonlittersize,anddifferentgenotypesintheothertwogroupsinthelittersizewasnotaffected,butthegenotypeofCTinsheeplambingmarkerneedsfurthervalidation.3DifferentialExpressionofSheepADAMTS-1GeneinDifferentTissuesandysisofExon5PolymorphoismTheysisofexpressiontyof8organsindicatedthattheexpressionofovaryinallgroupswassignificantlyhigherthanotherorgans,andtheexpressionleveloftherestorgansrankedfromhightolowwaskidney,heart,liver,lung,spleen,pituitary,andhypothalamus.TheexperimentshowedthattheovaryexpressionofADAMTS-1geneinSmallTailHanewes(multiple-births)was1.54and2.61timesofthatinMongoliaewes(twinbirths)andMongoliaewes(singlebirth)respectively.BasedontheADAMTS-1exon5geneysis,wefoundthatC1506TandG1509AappearedintheCDSregion,whichbothbelongedtothesynonymousmutation.ThreebandswerenamedasAA,ABandAC,andthesignificantysisindicatedthatthesethreegenotypeswerenotsignificantonlittersize.Theresultsofχ2fitnesstestshowedthatallsheeppopulationswereinHardy-weinbergequilibriumstate,andPICvaluebelongedtointermediateandmoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).TheresultsofthisexperimentindicatedthatADAMTS-1geneyedanimportantroleonthelittersizeofMongoliaewesandSmallTailHanewes,whichwaspreliminarilyconsideredastheprolificacymajorgeneofthe1.1繁殖力作為畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)性狀對于家畜而言繁殖力就是生產(chǎn)關(guān)聯(lián)候選已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[1]。，綿羊是最早被馴化的物種之一[2100人類隨著自身所需選擇出各類優(yōu)質(zhì)遺傳資源的綿羊品種。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中羊的15.8%(,2013)數(shù)產(chǎn)雙羔或者多羔因此增加綿羊每胎的產(chǎn)羔數(shù)是提高生產(chǎn)效益非常有效的措施，具有重要的意義。，部分優(yōu)良用國外品種被引入國內(nèi)后其中二代之后的雜種群體的繁殖性能直展，越來越多與綿羊差高數(shù)相關(guān)的候選與分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)，作為標(biāo)記輔助選擇（marker-assistedselection，MAS）在繁殖育種的實(shí)際應(yīng)用上積累了豐富的基[3]節(jié)且產(chǎn)單羔這類情況嚴(yán)重制約了我國綿羊產(chǎn)品我國養(yǎng)羊也的發(fā)展[3]。如果綿羊的常年和高繁殖力是養(yǎng)羊業(yè)對于綿羊產(chǎn)業(yè)且遺傳進(jìn)展極為緩慢[4]。之前人們利用傳統(tǒng)的育種方式進(jìn)行綿羊繁殖性狀的改Booroola羊[3。上述品種都具備常年且一胎多羔的優(yōu)良性狀。綿羊的品種不同表現(xiàn)出來的繁殖力也不盡相同，通常情況下北方牧區(qū)140%。小尾寒羊和湖羊作為我國優(yōu)良的高繁殖力地方品種，一般能一年產(chǎn)兩胎或者兩年三胎，雙羔多見，多的每胎產(chǎn)4至5與自然選擇，使與繁殖力相關(guān)的高產(chǎn)候選發(fā)生分離或者流向集中，最終導(dǎo)致1..2.2羊進(jìn)行短期優(yōu)飼對于提高母羊率有很大的幫助備孕母羊的維生素缺乏會導(dǎo)致數(shù)減少。1.2.3母羊的產(chǎn)羔隨 的增加而增加，初產(chǎn)母羊的平均產(chǎn)羔數(shù)顯著低于經(jīng)產(chǎn)羊，3-65-67歲物種的遺傳多樣性，利用遺傳多樣性規(guī)律有利物變異和一系列相關(guān)應(yīng)用。A發(fā)展和廣泛的應(yīng)用[5]。截至目前，根據(jù)生物大分子的不同，廣義的分子標(biāo)記可AA標(biāo)記。：存在與否及在間表達(dá)的差異可以反映出群體的遺傳狀況其蛋白質(zhì)的標(biāo)記主要包括兩類蛋白的標(biāo)記和同工酶酶標(biāo)記法。利用同工酶在組中對應(yīng)基因座的具置，同工酶標(biāo)記可以劃分為：等位同工酶和復(fù)等位同工酶。：DNA技術(shù)的不同DNA標(biāo)記可以分為以下三類：第一代，利用限制性內(nèi)切酶和SouthernPCRSNP[9-11]。RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）標(biāo)記法是利用限制性內(nèi)切酶（Restrictionenzyme,RE）把生物的同源片段進(jìn)行特利用這些長短不一的片段反應(yīng)DNA分子上不同酶切位點(diǎn)分布狀況，最早是由Grodzicker等[12]1974建立的第一代分子標(biāo)記技術(shù)，RELP標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)有穩(wěn)定性良好、等位的共顯性、可以標(biāo)記大量位點(diǎn)等。RELP技術(shù)中存在的不足例如組DNA多態(tài)性的探針難以尋找，操作復(fù)雜繁瑣。檢測周期過于冗長RELP技術(shù)中的缺點(diǎn)，加快了檢測的速度和效率。PCR-SSCP1984年Noumi[14]等對大腸桿菌野生型和突變型F1-ATPase利用非變性移率有差異，根據(jù)這一研究結(jié)結(jié)果為變異的檢測提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。而后在1989年，Orita等[15,16]人利用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性的檢測，并年對電泳后的凝膠染色進(jìn)行了改良，提出利用銀染法可以快速便捷的判定型，從此PCR-SSCP技術(shù)建立并且日趨純熟。PCR-SSCP（Polymerasechainreaction-singlestrandconformationalpolymorphism）DNARNA80PCR技術(shù)進(jìn)行檢測的第三代分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是利用軟件設(shè)計(jì)某一物種組DNA分子PCR設(shè)備進(jìn)行目的片段特異性擴(kuò)增，而后用擴(kuò)增的目的片段在高溫（99℃）DNA差異導(dǎo)致其遷移率有一定的差異呈現(xiàn)出不同的帶型。目的片段任意一條單鏈DNA中堿基序列出現(xiàn)變異(堿基的替換、缺失或者插入)都能導(dǎo)致單鏈構(gòu)象的改的輔助意義，避免盲目導(dǎo)致經(jīng)費(fèi)浪費(fèi)[18,19]。RAPDRAPDPCR技術(shù)的發(fā)展建立起來的，Wnliams和Welsh1990年分DNA多態(tài)檢測技術(shù)[20,21]。RAPDDNA多態(tài)性的獨(dú)特RAPD基本原理是利用一系列隨機(jī)排列的寡聚核酸單鏈（8～10個(gè)堿基）為一個(gè)引物再通過PCR對靶DNA組進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物利用凝膠電泳RAPD技術(shù)特點(diǎn)：（1）RAPDDNA樣品量較少、靈敏度高，PCR引物退火溫度低且允許一定的程序錯(cuò)配，RAPD引物的通用性較好可以適用于不同生物組分析，每次反應(yīng)只需要一個(gè)引物就可以擴(kuò)增出許多片段，（4RAPDRAPD技術(shù)的不足：RAPD技術(shù)不足：（1）RAPD檢測因素較多，其DNA模版濃度、Mg2+濃度、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差和穩(wěn)定不高[25]；（2）RAPD問題，不同出現(xiàn)大小一致條帶后，并不能說明不同擁有一條同源DNARAPD技術(shù)的應(yīng)用受一定的制約[27]BMPR-IB研究進(jìn)作為轉(zhuǎn)移生長因子β亞基(TGF-Β)受體的成員之一的骨形態(tài)受體蛋白IB，耳、骨骼、、下丘腦、等組織中都有較高的表達(dá)，同時(shí)參與 morphogeneticprotein-2)、BMP-4、BMP-6、BMP-15的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(LeeWSetal,2004)[28]。綿羊的BMPR-1B序列CDS區(qū)域長度為1509bp，編碼區(qū)共編碼502個(gè)氨基酸殘基，并被定位于綿羊第6號的4q22-23區(qū)間。BMPR-IB明BMPR-IB被確定為綿羊高繁殖效候選，新西蘭和法國學(xué)者發(fā)現(xiàn)Booroola綿羊BMPR-IB在編碼區(qū)發(fā)生A>G突變導(dǎo)致氨基酸子發(fā)生改BMPR-IBBMPR-IB蛋白受體部分失活，最終導(dǎo)致其功能無法正常進(jìn)行(MulsantPetal,2001,SouzaCJHetal,2001,WilsonTetal,2001)[29-31]FecBBooroola綿羊擁有較高的繁殖力。在此次發(fā)現(xiàn)之后FecB在其他綿羊品種都有證實(shí)，Garole羊群(HanrahanJPetal2004)[32]。2003年，我國的湖羊與小尾寒同樣也出現(xiàn)（軍墾型（華等，2010）[34]小鼠敲除BMPR-IB則會導(dǎo)致小鼠不育，可能是因?yàn)槿笔托∈蟮腗ishina發(fā)現(xiàn)缺失BMPR-IB的小鼠會出現(xiàn)生產(chǎn)不規(guī)律的周期和假孕現(xiàn)象，同時(shí)還觀察到細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞數(shù)目明顯少于野生型的小鼠-IB缺失突變導(dǎo)致小鼠顆粒小包分泌芳香化酶能力顯著減弱，在動(dòng)物合成雌激素的在mRNA轉(zhuǎn)錄水平也有明顯的減弱，環(huán)加氧酶在誘導(dǎo)卵丘生長過程中起著關(guān)鍵的作用，缺失此類酶缺失是導(dǎo)致體內(nèi)不孕的原因之一。的機(jī)制。BMP-4、BMP-15、GDF-9和BMPR-IB對于綿羊的影響較為明顯，其功能主要表現(xiàn)在孕酮分泌起到抑制作用或者對顆粒分化的調(diào)控，BMPR-IB是影響動(dòng)物繁殖力的主效因子。對于深入研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白及受體，尤其是BMPR-IB對于培養(yǎng)高繁殖力動(dòng)物提供有力的理論依據(jù)，ADAMTS-1研究進(jìn)、哺乳動(dòng)物的解聚蛋白樣金屬蛋白酶ADAMTS(a andmetalloproteinasewiththrombospondin-likemotifs,ADAMTS)中共有十九降解、生成、血管生成、止血過程、關(guān)節(jié)炎和等[37]。哺乳動(dòng)物的解聚蛋白樣金屬蛋白酶ADAMTS(a thrombospondin-likemotifs,ADAMTS)中共有十九個(gè)蛋白水解酶構(gòu)成參與了多種病理與生理學(xué)的過程其中例如外基質(zhì)的組裝和降解生成血管生成止血過程、關(guān)節(jié)炎和等。近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，各類與ADAMTS-1有著緊密的聯(lián)系A(chǔ)DAMTS-1可以影響腫瘤轉(zhuǎn)移和增生在[38,39]、結(jié)腸癌[40]、肺癌[39]和軟骨癌[41]等一系列都有ADAMTS-1的發(fā)現(xiàn)。ADADMTS成員最早是作為小鼠炎癥上調(diào)，其沒有跨膜結(jié)構(gòu)域并且存在I型TSP基序[42,43]。ADAMTS-1作為成員之一，是在小鼠結(jié)腸26、；cDA序列[44]s1可以分泌到細(xì)胞外并且與細(xì)胞外基ECM蛋白調(diào)節(jié)[45,46]s-1-末端金屬蛋白酶亞結(jié)構(gòu)與ECM蛋白合，降解蛋白聚糖、蛋白多糖和多功能蛋白聚糖[47，-1與血管的發(fā)生有重要的關(guān)聯(lián)是因?yàn)镸T-1可以與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合，進(jìn)而影響血管的生長[48]。在心血管疾病研究中[49]，例如動(dòng)脈硬化[50，心肌梗塞[38][51]TS-1對上述疾病存在著一定的關(guān)聯(lián)。s-1對孕酮的合成有一定的影響，并且可以合成孕酮。其L/HCG的合成有很大的關(guān)系，與此同時(shí)在顆粒細(xì)胞的表達(dá)直接影響囊狀的生成在卵丘細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)胞中也有s-1的表達(dá)，且對細(xì)胞的能育性有關(guān)系[52]。Richars等[47]用小鼠為試驗(yàn)樣本并且敲除s-1，結(jié)果表明被敲除ts-1的雌鼠與對照組相比，敲除s-1的雌鼠官畸形和繁育能力低下，導(dǎo)致其壁變厚，且存在許多旋繞內(nèi)出現(xiàn)大量的異常發(fā)育的包囊較對照組成熟數(shù)量下降明顯，導(dǎo)致不能，注射hCG與G后不孕等。此類現(xiàn)象只發(fā)生在雌鼠中，而公鼠并不影響其繁殖性能[53]可知s-1過調(diào)節(jié)過程的發(fā)生在雌性動(dòng)物中起著重要的作用。；近年來，在國內(nèi)鮑建軍等[54]以小尾寒羊、洼地綿羊、羊和湖羊?yàn)樵囼?yàn)樣本，通過ADAMTS-1的外顯子SNP位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀進(jìn)行分析研究。等[55]和[56]等以黔北麻羊、黑和半細(xì)毛羊?yàn)樵囼?yàn)對DNASNPs位點(diǎn)的突變對基RNAADAMTS-1可能會影響產(chǎn)羔性狀。PE公司在1995年研發(fā)成功并具有意義的熒光定量PCR技術(shù)，此項(xiàng)Real-TimePCRPCRPCRCtCt值(CyclePCRPCR的擴(kuò)增產(chǎn)物量，同時(shí)cDNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，再對這些Real-timePCRCtReal-timePCR定量分析法可以大致分為兩類，分別是相對定量分析法和絕對定量分析法相對定量分析法廣泛應(yīng)用與拷貝數(shù)的變化檢測中還有目的的mRNA表達(dá)水平的檢測領(lǐng)域中。而絕對定量法主要應(yīng)用在以及其他寄生相對定量分析（Relative相對定量的方法是利用未處理過的樣品和處理過后的樣品之間的目的表利用內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處內(nèi)參是指一類在各類樣本中拷貝數(shù)基本不變的核酸序列常用的內(nèi)參β-actin、GAPDH、ACTB、SDHA、28sRNA1、18sRNA等。cDNA合成率的差異等。如果不進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)話處理得到的數(shù)據(jù)差異就會很大計(jì)算每一個(gè)待測樣本與校正樣本的目的和內(nèi)參的比值從而得到一個(gè)比例，如下樣本的相對濃度目 的濃內(nèi) 的濃可以校正同一批次實(shí)驗(yàn)中不同樣本數(shù)量和質(zhì)量之間的差異[60]目標(biāo)及內(nèi)參在不同批次的檢測過程中可能會因?yàn)樘结槒?fù)性淬滅目的及內(nèi)參不同批次的檢測過程會出現(xiàn)一些因?yàn)樘结槒?fù)性淬滅系PCR反應(yīng)提供一個(gè)恒定的校正點(diǎn)。：

利用此類處理的目的是,可以對不同批次和不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行恒定的校正，能夠準(zhǔn)確校正時(shí)間和時(shí)間、批次和批次的多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的差異。(1)2－△△Ct2-△△Ct分析是在Real-timePCR最為常見的一類分析方法。此類方法的特點(diǎn)是假定目的和內(nèi)參的擴(kuò)增效率都為100％（每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量5％PCR①用待測樣本（校準(zhǔn)樣本）內(nèi)參的Ct值歸一待測樣本（校準(zhǔn)樣本）的目的的Ct值ΔCt(sample)=Ct(target,sample)－Ct(reference, 用校正樣本的ΔCt歸一待測樣本ΔCtΔΔCt=ΔCt(sample)－ΔCt(calibrator)=2－△△Ct（2target：目的reference：內(nèi)參sample：待測樣本；calibrator：校對照組驗(yàn)通過分析綿羊產(chǎn)羔性狀與綿羊BMPR-IB和ADAMTS-1多態(tài)性位點(diǎn)關(guān)系，及ADAMTS-1實(shí)時(shí)熒光定量分析法對不同羊品種組織間差異表達(dá)量第二章綿羊BMPR-IBCDS區(qū)864位點(diǎn)多態(tài)性及所需的羊由省永昌縣養(yǎng)殖示范戶提供，小尾寒羊由隴西縣菜子鎮(zhèn)旺旺母羊養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社提供，高山細(xì)毛羊由張掖市肅南縣畜牧站提供，湖羊由武威三洋農(nóng)牧公司提供。羊只均為2~3歲、產(chǎn)羔胎次2~3胎的成年經(jīng)產(chǎn)母羊。頸靜脈血樣，肝素鈉抗凝采血管-20°C保存?zhèn)溆?。雙丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、TrisView核酸均購自全式金生物（）；PCR擴(kuò)增所需引物由蘇州生物科技合成。DNA（1）ACD1.4712g0.4809g1.3205g，加100mL。ACD1:7，現(xiàn)配現(xiàn)用。（2）1mol/LTris-HCl12.11gTris80mLHCl調(diào)pH8.0100mL，高壓滅菌備用。100mL。Tris-HCl1mL100mL。氯仿:異戊醇（24:1）：24:1的比例混勻，置于棕色瓶中TE（pH8.0）：1mol/LTris-HCl10mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）2mL，加100mLpH8.0，高壓滅菌，4℃保存。PCR（pH8.0），100mL（2）10×TBE108gTris堿，55g硼酸，40mL0.5mol/L（pH8.0），1000mL（3）1×TAE緩沖液：50×TAE1:49（4）1×TBE緩沖液：10×TBE1:9（5）1.0%1g100mL1×TBE緩沖液中，加熱使（6）2.0%2g100mL1×TBE（8）10%1g10mL超純水溶解，4℃SSCP2沖液：98%1960μL，0.5mol/LEDTA40μL，二甲苯0.025%，溴酚藍(lán)0.025%。固定液：50mL無水乙醇，2.5mL500mL顯影液：7.5gNaOH，2.0mL，加水定容至250mL影效果較好；未特別部分的為蒸餾水；高壓滅菌條件為：121℃，1.1綿羊血液本試驗(yàn)用羊血樣均為頸靜脈采血，ACD抗凝，生物冰袋低溫，-20℃保存綿羊組DNA的提綿羊血液組DNA提取方法參照本課題組改進(jìn)的常規(guī)飽和酚抽提法。如下500μL1.5ml繼續(xù)向離心管中加入1000μL細(xì)胞裂解液，為了使細(xì)胞充解劇烈震2-4min,46000rpm5min；(4)3;300μL5-(24:1)4℃6000rpm500μL1000μL的預(yù)冷無水DNA沉淀析出，4℃13000rpm2min；5μL1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。綿羊血液DNA1.0g100mL1×TAE電泳至55℃時(shí)備用。凝膠液與混勻。水品狀態(tài)），輕搖凝膠槽保證凝膠液均勻分布與槽中。置于室溫10-20min，待1×TAE電3～5mm。加樣品事前準(zhǔn)備一只干凈平整的PE手套，利用移液槍吸取1μL5×DNALoadingbuffer5μL待測樣溶液，利用移液槍充分使二者混勻，最后將混好樣品加入瓊脂糖凝膠的梳孔中，在邊緣的梳孔中加入DL2000LadderMarke100V電壓下15-25min。首先用超純水/RNase-ddH2O將石英比色皿潤洗，用鏡紙將水吸干利用TE/RNase-ddH2O校正紫外分光光度計(jì)吸取5μL待測DNA/RNA溶液，并用TE溶液/RNase-ddH2O稀釋至3mL，280nm260nmODDNA/RNADNA（μg/μL）=OD260×50×稀釋倍數(shù)/1000DNAOD260/OD280OD260/OD280>2.0RNAOD260/OD280≈1.8DNAPCRBMPR-IB多態(tài)性位點(diǎn)引物設(shè)根據(jù)已經(jīng)公布的綿羊BMPR-IBmRNA序列（GenBank登錄號: .1），結(jié)合本試驗(yàn)步驟2.6.1的試驗(yàn)結(jié)果，對BMPR-IB部分多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（P1）引物序列見表2.2.3.。Table2.3PolymorphismLociPrimerofBMPR-IBPCRPCR擴(kuò)增效率的因素有很多例如退火溫度、模版的濃度、模版的質(zhì)量、鎂離子的濃度等。PCR反應(yīng)的優(yōu)化是為了獲得最佳擴(kuò)增效率的條件，而且還要PCRPCR25μLdd 10×PCRLoadingBuffer Primer Primer Taq 模板 共 PCR2.4PCRTable2.4TheBestamplifiedreactionprogramofPCR2.2.3.1。PCR1×TBE電泳緩沖液。7uL的變性劑，3uLPCRPCR管中混勻。混勻后的樣10°C，140V，18mA，3W，4固定結(jié)束后，加入適量的銀染液，在搖緩慢搖動(dòng)7min。再用蒸餾水漂洗2.6Table2.6FormulofPolyacrylamide根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，人工判斷型PCR2對造成。PCR頻率和型頻頻 p(A)

q(B)

其中：p(A):是等位A的頻率，q(B)：是等位B的頻率，nAAnAB、nBB分別指該群體中AA、AB和BB型的數(shù)型頻率是指一個(gè)群體中某一特定型的數(shù)占全部數(shù)的比率閉的間隨機(jī)交配的群體中頻率和型頻率在世代交替過程中Hardy-WeinbergP=p2H=2pqQ=q2nAB′=(nAA+nAB+nBB)HnAA′=(nAA+nAB+nBB)PnAB′=(nAA+nAB其中：p=(2nAA+nAB)/[2(nAA+nAB+nBB)]，q=(2nBB+nAB)/[2(nAA+B的頻率。nAA、nAB和nBB分別為該群體中AA、AB和BB型的數(shù)nAB′、nAA′nAB′nAA、nABnBBHardy-Weinbergχ2

n

1=OiEi

=OiEi2 矯

i Ei：理論期望值；Oi：實(shí)際觀察值；n：等位群體純合度（Homozygosity，Ho）、雜合度(Heterozyosity，He)、有效等位基因數(shù)(HeterozyosityNe)和多態(tài)信息含量(polymorphisminformationPIC)是評價(jià)群體內(nèi)遺傳多樣性的指標(biāo)。（He

HoHoi

；

HeHe1i有效等位iNe i中，Ne為有效等 數(shù)，Pi為第i個(gè)有效等 頻率多態(tài)含當(dāng)PIC>0.5時(shí)屬于高度多態(tài)，0.25<PIC<0.5屬于中度多態(tài)，PIC<0.25屬于低度 m1PIC1P22P2i

i1j將DNA組樣品，用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(2-1)。條帶單一無雜帶，說明DNA完整性較好，可以進(jìn)入下游試驗(yàn)。Figure2-1GenomicDNAdetectionofsheepBMPR-IBPCR目的產(chǎn)物擴(kuò)Figure2-2P1PCRamplificationofBMPR-IBgeneinPCR-SSCPSSCPP1和B兩個(gè)等位，并且存在3種帶型，分別為AA、BB、AB(圖2-3)圖2-3綿羊BMPR-IBSSCP檢Figure2-3SSCPdetectionofBMPR-IBgenein2.4.4為了保證試驗(yàn)所得的可靠性，將AA、BB、AB帶型的樣品各取兩份送去公司發(fā)現(xiàn)1020位點(diǎn)(編碼區(qū)864)出現(xiàn)突變C→T序列比對及峰值(圖2-4、2-5)Figure2-4ThecomparisonofBMPR-IBgenecodingsequencesofinAA BB AB圖2-5綿羊BMPR-IBAA型、AB型、BB型比Figure2-5SequencecomparisonofAA,ABandBBgenotypesofsheepBMPR-IB2.4.5頻率和型頻對于四種綿羊品種(小尾寒羊多羔、湖羊多羔、羊單雙羔和高山細(xì)456SSCP2-1)。湖羊母羊以及小尾寒羊母羊的優(yōu)勢型均為AA型而羊母羊和高山細(xì)毛羊母羊AB型頻湖羊三種綿羊χ2值和G2值均為達(dá)到顯著水平(p>0.05),而羊的χ2值和G2值達(dá)到顯著水平(P<0.05)。說明除了羊其他三種羊均達(dá)到Hardy-weinberg平衡狀態(tài)。四種綿羊的觀測值F在BMPR-IB中均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，且接PIC和湖羊(PIC<0.25)，而在羊和高山細(xì)毛羊信息含量處于中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5)(2-2)。表2-1型和頻Table2-1Genotypeandallele2-2Table2-2Geneticpolymorphism2.4.6、、、、、、利用SPSS21.0軟件對BMPR-IB的編碼區(qū)864位點(diǎn)的三種不同的分布差異性檢測(表2-3)。檢測所得可知在高山細(xì)毛羊單羔和小尾寒羊多羔之間、高山細(xì)毛羊單羔和羊單羔之間、高山細(xì)毛羊單羔和羊單羔之間高山細(xì)毛羊單羔和羊雙羔之間高山細(xì)毛羊單羔和湖羊多羔之間高山細(xì)毛羊雙羔和小尾寒羊多羔之間高山細(xì)毛羊雙羔和羊單羔之間高山細(xì)毛羊雙羔和湖羊多羔之間羊單羔和湖羊多羔之間、蒙古羊雙羔和湖羊多羔之間差異極顯著(P<0.01)。高山細(xì)毛羊雙羔和羊雙、、、、、、、之間羊單羔和羊雙羔之間、湖羊多羔和小尾寒羊多羔之間分布差異不、表2-3不同型在綿羊品種中的分布差異檢Table2-3Testofthedistributionofdifferentgenotypesinsixsheep注AAP>0.05,AB0.01<P<0.05,ACP<0.01。表P值Note:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentPvalue2.4.7BMPR-IB多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀分在不同型間最小二乘積所得如下。AA型、AB型、BB型之間的最2.4703(1.2166)、1.7347(0.8357)、1.3846(0.5064)3.199(0.0015)ABBB1.490(0.1377)。不同型與品種互作效應(yīng)的最小二乘積分析，3種型與四種綿羊有種互做效應(yīng)(羊小尾寒羊湖羊無BB型)(表4)高山細(xì)毛羊×AA(1.3684高山細(xì)毛羊×AB(A×AB)1.377 6、小尾寒羊×AA(S×AA)3.0000、小尾寒羊×AB(S×AB)3.0000、湖羊×AB(H×AB)3.5333。不同型與品種之間互作效應(yīng)后多重比較(表4)，A×ABA×AA之間、A×BBA×AA之間、A×ABA×BB之間、A×AA與P0.05P0.001。表2-4品種與型互作與不同產(chǎn)羔類型綿羊分布差異的獨(dú)立樣本檢Table2-4Testofin ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming注：A×AA高山細(xì)毛羊×AA型;A×AB高山細(xì)毛羊×AB型;A×BB高山細(xì)毛×BB型;S×AA小尾寒羊×AA型;S×AB小尾寒羊×AB型;M×AA羊×AA型;M×AB羊×AB型H×AA湖羊×AA型H×AB湖羊×ABNote:A×AAindicatesGansualpinemerinoewesandAAgenotype;A×ABindicatesGansualpinemerinoewesandABgenotypy;A×BBindicatesGansualpinemerinoewes×BBgenotypy;S×AAindicatesSmallTailHanewes×AAgenotypy;S×ABindicatesSmallTailHanewes×ABgenotypy;M×AAindicatesMongoliaewe×AAgenotypy;M×ABindicatesMongoliaewe×ABgenotypy;H×AAindicatesHuewes×AAgenotypy;H×ABindicatesHuewes×ABgenotypyBMPR-IB在多種組織中都存在BMPR-IB的表達(dá)是調(diào)節(jié)和分化的重要蛋白受體。近年來，研究表明，BMPR-IB對于的調(diào)節(jié)主要在于抑制其分泌酮或控制顆粒細(xì)胞的分化成熟，進(jìn)而間接動(dòng)物的繁殖(Yietal.,2001)[61]。FecB突變是發(fā)生在綿羊BMPR-IB編碼區(qū)746位(A→G)突變，從而導(dǎo)致攜帶該突變 數(shù)提高，研究推測其突變可能導(dǎo)致對激素的敏感程度提高(Montgomeryetal.,1992)[62]。也有研究表明該突變導(dǎo)致激素的分泌水平提高(Montgomeryetal.,2001)[63]。但是其配體的多樣，通路復(fù)雜，功能多樣，目前對其調(diào)節(jié)機(jī)制并不能確定而且目前研究中對于綿羊編碼區(qū)中的同義突變較少本實(shí)驗(yàn)通過利用了直接法和PCR-SSCP技術(shù)對高山細(xì)毛羊單雙羔、羊單雙羔、小尾寒羊多羔和湖羊多羔的BMPR-IB編碼區(qū)864位T→C突變進(jìn)行關(guān)聯(lián)性的分析。發(fā)現(xiàn)456只綿羊中，都存在AA型和AB型，而在BBChu等(2011)[64]試驗(yàn)所得不同，等位均是A，而頻率中小尾寒羊和湖羊的優(yōu)勢均為AA，在羊量可知，屬于低度多態(tài)的是小尾寒羊和湖羊(PIC<0.25)，而在羊和高山記位點(diǎn)，對提高選育高產(chǎn)羔率的綿羊有一定的價(jià)值。G2χ2適合性檢測表明，不同母羊產(chǎn)羔性狀與型相關(guān)性分綿羊的繁殖性狀屬于低遺傳力性狀之一主要原因是由于主效與微效基因相節(jié)控制的對于尋找主效多胎品系以此提高綿羊的繁殖性能有著重要的意義，BMPR-IB是作為湖羊、小尾寒羊等高繁殖性能綿羊的主效(東等，2005)[65]Q249R突變，本次試并且存在三種型AA，AB，BB。該點(diǎn)突變屬于同義突變，并沒有引起氨基小尾寒羊、湖羊，羊與小尾寒羊、湖羊中差異呈現(xiàn)顯著(P<0.05)。高山細(xì)毛羊和羊之間的差異也存在顯著性(0.01<P<0.05)但在高繁殖力綿羊品種湖羊與小尾寒羊中差異并不明顯(P>0.05)。利用品種和產(chǎn)羔數(shù)互作后與型做況下導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的分化和細(xì)胞的發(fā)育(Kimchi-Sarfatyetal.,2007)[66]。因864突變可作為控制綿羊繁殖性狀的分析標(biāo)記位點(diǎn)。456BMPR-IB的第八外顯子中發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)864位C→T突變，發(fā)現(xiàn)三種型AA、AB、BB。其中只有在高山細(xì)毛羊中發(fā)現(xiàn)BB型，而其他群體均只有兩種型AA、BMPR-IB在不同繁殖力綿羊品種中間差異明顯，其是否是可以作為綿羊產(chǎn)第三章綿羊BMPR-IB部分3端非編碼區(qū)多態(tài)2.2.1試驗(yàn)樣品2.2.2DNA的提取2.2.3綿羊血液樣品的檢測本試驗(yàn)中所用引物均利用Olig6.0和Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件相合而設(shè)計(jì)BMPR-IB3端非編碼區(qū)引物設(shè)根據(jù)已經(jīng)公布的綿羊BMPR-IBmRNA序列（GenBank登錄號: .1），結(jié)合本試驗(yàn)步驟2.6.1的試驗(yàn)結(jié)果，對BMPR-IB部分多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（P2）引物序列見表3-1。表3-1BMPR-IB部分多態(tài)位點(diǎn)引Table3-1PolymorphismLociPrimerofBMPR-IBPCRPCR同第二章PCR同第二章PCR同第二章同第二章綿羊血液組的提同第二章BMPR-IBPCR目的產(chǎn)物擴(kuò)BMPR-IB引物P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰無雜帶（圖3-1），大小分別為150bp符合預(yù)期大小圖3-1綿羊BMPR-IB引物P2PCR產(chǎn)Figure3-1P2PCRamplificationofBMPR-IBgeneinPCR-SSCPSSCPP2A和B兩個(gè)等位，并且存在3種帶型，分別為CC、CT、CG(圖3-2)圖3-2綿羊BMPR-IBSSCP檢Figure3-2SSCPdetectionofBMPR-IBgeneinCC、CT、CG帶型的樣品各取兩份送去測序公司，三種型CC、CT、CG進(jìn)行分析，在CT型中，BMPR-IB非編碼區(qū)第511位點(diǎn)雜合C>T，在CG型中，非編碼區(qū)544位點(diǎn)雜合C>G（3-4）。 圖3-4綿羊BMPR-IBCC型、CT型、CG型比Figure3-4SequencecomparisonofCC,CTandCGgenotypesofsheepBMPR-IB頻率和型頻對于三種綿羊品種(小尾寒羊多羔羊單雙羔和高山細(xì)毛羊單雙羔)共計(jì)341樣本SSCP分析所得如下(表3-2)。三種綿羊的優(yōu)勢等位均為C。甘肅高山細(xì)毛羊雙胎、羊單胎綿羊χ2值和G2值均未達(dá)到顯著水平(p>0.05),而羊雙胎、高山細(xì)毛羊單胎、小尾寒羊多胎的母羊χ2值和G2值達(dá)到顯著水平(P<0.05)。說明羊雙胎、高山細(xì)毛羊單胎、小尾寒羊多胎母羊群體Hardy-weinberg平衡狀態(tài)。三種綿羊的觀測值F在BMPR-IB中均處于95%多態(tài)的是高山細(xì)毛羊單胎母羊(0.25<PIC<0.5))，其余綿羊群體均為高度多態(tài)(PIC>0.5)(3-3)。表3-2型和頻Table3-2Genotypeandallele3-3Table3-3Geneticpolymorphism、三種型分布差異檢測(表3-4)。高山細(xì)毛羊單羔和高山細(xì)毛羊雙羔高山細(xì)毛羊單羔和羊單羔之間、高山細(xì)毛羊單羔和羊雙羔之間差異極顯著(P<0.01)。高山細(xì)毛羊單羔與小尾寒羊多羔之間差異顯著、(0.01<P<0.05)。其余組之間差異不顯著(P>0.05)表3-4不同型在綿羊品種中的分布差異檢Table3-4Testofthedistributionofdifferentgenotypesinfivesheep注AAP>0.05,AB0.01<P<0.05,ACP<0.01。表P值Note:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentPvalue在不同型間最小二乘積所得如下。CC型、CT型、CG型之間的最小二乘積及標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.63(0.689)、1.96(0.723)、1.50(0.675)。兩兩進(jìn)行獨(dú)TCTCC、CG3.512(0.0005)、4.328(<0.0001)。CCCG1.456(0.1470)。不同型與品種互作效應(yīng)的最小二乘積分析，3種型與三種綿羊9種互做效應(yīng)(表3-5)。高山細(xì)毛羊×CC(A×CC)1.49、高山細(xì)毛羊、×CT(A×CT)1.64、高山細(xì)毛羊×CG(A×CG)1.23、小尾寒羊×CC(S×CC)3.0000小尾寒羊×CT(S×CT)3.0000小尾寒羊×CG(S×CG)3.000羊、、、 、、之間互作效應(yīng)后多重比較(4)，A×CCA×CT之間、A×CCM×CC之間、A×CCM×CT之間、A×AAM×CG之間、A×CTM×CC之間、A×CT與M×CT之間、A×CTM×CG之間、A×CTM×CC之間、S×CCS×CT之間、S×CCS×CG之間、S×CTS×CG之間、M×CCM×CG之間、M×CC之間、A×CGM×CC之間、A×CGM×CG之間差異顯著(0.05<P<0.01)，其P0.001。表3-5品種與型互作與不同產(chǎn)羔類型綿羊分布差異的獨(dú)立樣本T檢Table3-5Testofin ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming注：A×CC高山細(xì)毛羊×CC型;A×CT高山細(xì)毛羊×CT型;A×CG高山細(xì)毛×CG型S×CC小尾寒羊×CC型S×CT小尾寒羊×CT型S×CG小尾寒羊×CG型M×CC羊×CC型;M×CT湖羊×CT型;M×CG羊×CGNote:A×CCindicatesGansualpinemerinoewesandCCgenotype;A×CTindicatesGansumerinoewesandCTgenotypy;A×CGindicatesGansualpinemerinoewes×CGgenotypy;S×CCindicatesSmallTailHanewes×CCgenotypy;S×CTindicatesSmallTailHanewes×CTgenotypy;S×CGindicatesSmallTailHanewes×CGgenotypy;M×CCindicatesMongoliaewe×CCgenotypy;M×CTindicatesMongoliaewe×CTgenotypy;M×CGindicatesMongoliaewe×CGgenotypy。、的3′端非編碼序列在轉(zhuǎn)錄后的加工起著調(diào)控的作用，其中涉及了mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率等一系列生理進(jìn)程的調(diào)節(jié)，國內(nèi)外目前關(guān)于對BMPR-IB的非編碼序列鮮有涉及[67,68]。賈立新等[69]對BMPR-IB基因部分3′非編碼區(qū)序列進(jìn)行直接和PCR-SSCP技術(shù)檢測高繁殖力和低繁殖而在其余三種綿羊（小尾寒羊、特克羊和中國美利奴綿羊）并沒有發(fā)現(xiàn)這類突變。目前研究認(rèn)為，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域主要集中在的5′端，也就5′包含3′mRNA的轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平的調(diào)控并非必須[70]。的3′端非編碼區(qū)包含大量的堿基有著豐富的遺傳信息[70]3′miRNA主要來源，抑制靶序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的合成[71]3′端非編碼區(qū)序的過程[72,73]，對于雄性哺乳動(dòng)物的形成有一定的調(diào)節(jié)作用[74,75]。本次試PCR-SSCP33′511544位點(diǎn)兩個(gè)位置額點(diǎn)突變進(jìn)行了多態(tài)性的檢測分析。結(jié)果表明，3341個(gè)樣本中，存在3種型，CC型、CT型和CG型，在3′非編碼序列第511位點(diǎn)和544位點(diǎn)發(fā)生了C>T突變和C>G的突變，第430bp到580bp擴(kuò)增后三種型分布差異檢測高山細(xì)毛羊單羔和高山細(xì)毛羊雙羔高山細(xì)毛羊單羔和羊單羔之間、高山細(xì)毛羊單羔和羊雙羔之間差異極顯著(P<0.01)。。、在不同型間最小二乘積所得如下。CC型、CT型、CG型之間的區(qū)擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)三種型CC、CT、CG。在高山細(xì)毛羊母羊群體中，CT型對于產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，而在其他兩第四章綿羊ADAMTS-1在不同組織間差異表達(dá)試驗(yàn)所需的羊由省永昌縣養(yǎng)殖示范戶提供，小尾寒羊由隴西縣菜子鎮(zhèn)母羊養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社提供，頸靜脈血樣，用ACD抗凝管-20°C保存；另外分別期的羊單羔母羊(4只)、羊雙羔母羊(4只)和小尾寒羊多羔母(4只)的、垂體、下丘腦、心臟、脾臟、肺臟、肝臟、RNATapDNADNAMaker寶生物公司(大連)雷磁PHST-4A型pH計(jì)（精密科學(xué)儀器）、SartoriusAA-160型電子讀數(shù)天平（賽多利斯儀器系統(tǒng)）、NanoVue分光光度計(jì)（GESigmaABICTYD0.5-10CTYD10-100CTYD200-1000，英國）、高速冷凍離心機(jī)（BiofugeSrats，熱電），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-BET140E，SM）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥（G-9146A精宏恒溫水?。≒-DHS-5065-B，）、電動(dòng)移液器（BioMate，熱電）、冰箱（-219，青島海爾），-1000型紫外分光光度儀（NnoDrop）等。熒光定量PR儀：RocheLightycler480PRPR所需的儀器設(shè)備。綿羊組DNA的提綿羊血液組DNA提取方法參照本課題組改進(jìn)的常規(guī)飽和酚抽提法。如下500μL1.5ml繼續(xù)向離心管中加入1000μL細(xì)胞裂解液，為了使細(xì)胞充解劇烈震2-4min,4℃6000rpm5min；(4)3;300μL5-勻，4℃6000rpm10min；500μL1000μLDNA，4℃13000rpm5μL1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩＞d羊總RNARNA（寶生物）330min，烘干備用。EraserSpinColumnmLgDNAEraserSpinColumn2ml70%RNASpinColumn重復(fù)步驟25℃，12000g，2min，RNASpinColumn50mLDEPC-H2O，DNA和RNA三角瓶中加入適量的核酸（100mL緩沖液約5uLGoldView），輕搖使凝膠液與混勻。品狀態(tài)），10-20min，待凝3～5mm。加樣品事前準(zhǔn)備一只干凈平整的PE手套，利用移液槍吸取1μL5×DNALoadingbuffer5μLDL2000LadderMarke100V15-25min首先用超純水/RNase-ddH2O將石英比色皿潤洗，用鏡紙將水吸干利用TE/RNase-ddH2O校正紫外分光光度計(jì)吸取5μL待測DNA/RNA溶液，并用TE溶液/RNase-ddH2O稀釋至3mL，280nm260nmODDNA/RNADNA（μg/μL）=OD260×50×稀釋倍數(shù)/1000DNAOD260/OD280OD260/OD280>2.0RNAOD260/OD280≈1.8DNARTreagentKitwithgDNAEraser先在0.5mLRNase-的PCR管中加入成分：將以上組分混勻，42℃2min37℃15min，85℃5seccDNA20℃PCR參照GENEBANK中綿羊ADAMTS-1(登錄號：GU437212)cDNA全列，使用Primer5.0設(shè)計(jì)引物。以β-actin(NM_ 4-1)。引物由蘇州生物科技合成。4-1Table4-1primerPCRPCR離子的濃度等。PCRPCRDNA物質(zhì)量的下，維持其他條件不變，僅改變其中任意一個(gè)條件，將該條件設(shè)PCRPCR25μLdd10×PCRLoadingPrimerPrimerTaqPCR4-2PCRTable4-2TheBestamplifiedreactionprogramof熒光定量RocheLightCycler480ⅡPCR個(gè)樣品的目的表達(dá)量用β-actin作為內(nèi)參對照定量PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C，2 min；95°C，15 s，60°C(ADAMTS-1)/60°C(β-actin)30s，72°C，30s，40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)的退火以及延60s；4°C，30s。對照用0.2mLddH2O代替模版。結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成溶體的不同組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)在同一批進(jìn)行。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性每個(gè)樣品進(jìn)行410-1、10-2、10-310-4cDNA為模版進(jìn)行熒光定量分析，選擇表達(dá)最為合適(Ct值)cDNA樣品為標(biāo)準(zhǔn)品。PCRPCR同第二章同第二章頻率和型頻表達(dá)量通過2-△△Ct計(jì)算(Zhangetal.,2014)[76]。不同組織中ADAMTS-1SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用Duncan’sP<0.05，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=10)表示。綿羊ADAMTS-1的組織表達(dá)分、利用RT-PCR技術(shù)對羊單羔母羊羊雙羔母羊和小尾寒羊多羔母羊心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、下丘腦、垂體、8個(gè)組織ADAMTS-1基(4-1)。、圖4-1綿羊母羊ADAMTS-1在8種組織的RT-PCR電Figure4-1RT-PCRelectrophoresispatternofADAMTS-1genein8organsof注:1;2心臟;3肝臟;4肺臟;5脾臟;6下丘腦;7垂體;8腎Note:1ovary;2heart;3kidney;4lung;5spleen;6hypothalamus;7pituitary;8中的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對綿羊ADAMTS-1在8組織中表達(dá)量進(jìn)行分析，內(nèi)參B-actin和目的ADAMTS-1溶解曲線(圖4-2)，可知兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值均一，溶解曲線上呈現(xiàn)明顯的單峰，說明Q-PCR反應(yīng)過程中，兩種引物擴(kuò)增特異性效果良好，沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增AB圖4-2綿羊ADAMTS-1和B-actin的溶解曲Figure4-2MeltingcurveforsheepADAMTS-1geneandB-actin綿羊ADAMTS-1的表達(dá)水平，三個(gè)綿羊群體的表達(dá)量高于其他組垂體、下丘腦(圖4-3)。同一組織不同綿羊表達(dá)水平分析可知，中小尾寒羊多羔母羊與羊單羔母羊、羊雙羔母羊表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，羊雙羔母羊和羊單羔母羊差異顯著(P<0.05)，且小尾寒羊多羔的表達(dá)量是、羊雙羔母羊的1.54倍羊單羔母羊的2.61倍。其余組織間差異不顯著、ABFigure4-3TheexpressionlevelofADAMTS-1geneindifferentorgansofthreekindsof注:A中不同小寫字母表示同一組織在不同綿羊群體下的表達(dá)量差異顯著(p<0.05,N=10,mean±S.E.)B中不同大寫字母表示同一綿羊群體下不同組織中的表達(dá)量差異顯著(p<0.05,N=10,mean±S.E.)Note:DifferentlowercaselettersinAindicatesthattheexpressionofthesameorganwassignificantlydifferent(p<0.05,N=10,S.E.+mean)indifferentsheeppopulations;DifferentcapitallettersinBindicatesthattheexpressionlevelsofdifferentorgansinthesamesheeppopulationweresignificantlydifferent(p<0.05,N=10,mean+S.E.)綿羊ADAMTS-1第五外顯子多態(tài)性分依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康乃O(shè)計(jì)的引物分別對綿羊血液組樣品進(jìn)行擴(kuò)增，利用2％4)Figure4-4ThePCRdetectionofsheepADAMTS-1geneexonSSCPP1