葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2023/7/18葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變

1、文章摘要本文對釀造葡萄酒中戊唑醇農(nóng)藥殘留變化進行了研究，對葡萄、未發(fā)酵的葡萄汁、葡萄酒利用氣相-離子阱質(zhì)譜(GC–ITMS)檢測方法進行檢測，戊唑醇保留在了酒渣和酒糟以及澄清介質(zhì)上。在終酒中戊唑醇的減少量是86%。同時通過模擬實驗對戊唑醇對釀酒酵母和酒球菌發(fā)酵活力影響進行研究，運用LC–MS/MS來檢測模擬實驗中未發(fā)酵葡萄汁和葡萄酒中的戊唑醇的殘留。結(jié)果農(nóng)殘對酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵無影響，未檢出微生物對戊唑醇的降解產(chǎn)物。2葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變試驗的兩個目的：第一是通過整個試驗研究紅葡萄酒在加工過程中戊唑醇的殘留量的變化。第二是通過模擬試驗來研究戊唑醇殘留對酵母菌的酒精發(fā)酵和酒球菌的蘋果酸乳酸發(fā)酵的影響。檢測葡萄酒中微生物的存在是否對戊唑醇殘留的減少有促進作用。葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.1葡萄酒釀造試驗葡萄酒釀造試驗A和B，各做兩個重復(fù)，用2007年九月收貨的葡萄進行試驗。A組去梗破碎后不添加農(nóng)藥進行葡萄酒釀造試驗。B組去梗破碎后添加農(nóng)藥進行釀造試驗，添加戊唑醇的標(biāo)準品達到3.3mg/kg（這個水平是歐洲MRL,2.0mg/kg的1.6倍多）。A組和B組的釀造方法相同。4葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.1.1、葡萄就釀造過程成串的葡萄稱取40kg,總共四份。釀造過程如下：每份去梗破碎的葡萄放入金屬容器中進行發(fā)酵，添加SO2(40mg/L)，僅對B組添加農(nóng)藥，其他不添加，24小時后添加商業(yè)酵母，酒精發(fā)酵在18℃-20℃進行發(fā)酵，保持10天，在10-11天，酒精浸漬發(fā)酵溫度低于18℃-20℃，期間為防止葡萄皮浮起，每天按下兩次。在發(fā)酵的最后進行壓榨，酒和未發(fā)酵的葡萄汁轉(zhuǎn)移進另一個金屬容器加入酒球菌進行蘋果酸乳酸發(fā)酵，在釀酒的最后過程進行過濾，添加SO2終止發(fā)酵，卵清蛋白進行澄清，最后進行灌裝。5葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變6葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.1.2.取樣根據(jù)表所述，為了研究不同釀酒步驟對戊唑醇減少的影響，酒精發(fā)酵之前對破碎的葡萄取樣；在酒精發(fā)酵的最后對酒和果渣進行取樣；在蘋果酸乳酸發(fā)酵的最后，對已過濾后的酒樣進行取樣；經(jīng)過澄清，對瓶裝的酒進行取樣。7葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.2.化學(xué)藥品2.2.1.戊唑醇提取和測定用試劑。

戊唑醇純度>98%,戊唑醇D6(100mg/l,溶于丙酮，作為內(nèi)標(biāo)物)，用于矯正色譜法中的進樣誤差和質(zhì)譜檢測的響應(yīng)值。2-乙氧基-1,2-丙二醇、山梨醇、古洛糖酸γ-內(nèi)酯用于被分析物的保護劑，溶劑（殘留量分析等級）是丙酮，乙腈，蟻酸，超純水，二氯甲烷，甲醇和甲苯。Nacl，無水硫酸鈉，氨基甲酸鹽。殺菌劑的標(biāo)準溶液和被分析物的保護劑在實驗開始之前準備好。8葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.2.2.模擬葡萄汁試驗用到的藥品

材料和培養(yǎng)基（蛋白胨，酵母提取物，瓊脂和MRS培養(yǎng)基）來自Cultimed。葡萄糖，96%的乙醇，甘油，蘋果酸，NaCl，CaCl2，H2SO495–98%，NaOH，3-5二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉。

9葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.3.材料和儀器2.4

提取步驟破碎的葡萄(5g),未發(fā)酵的葡萄汁和葡萄酒(各5mL)的樣本在50ml的聚丙烯做的螺旋帽的離心管中進行稱量。25ml的二氯甲烷和丙酮(75:25,v/v)加入容器進行超聲波浴10分鐘來完全混合均勻。NaCl（3g）和無水硫酸鈉（12g）加入后混勻5分鐘。經(jīng)過10分鐘，4000轉(zhuǎn)的離心分離后，把15ml有機物層轉(zhuǎn)入40ml的瓶中在氮氣流中干燥，殘留物重新溶于2ml的乙腈液中。凈化為了將雜質(zhì)去除干凈，進行固相萃取，使用SupelcleanEnviCarb-II/PSASPE固相萃取小柱，用乙腈：甲苯（3;1）5ml活化，將2ml的乙腈提取物上樣，被吸附的農(nóng)藥殘留用乙腈和甲苯（3;1）20ml進行洗脫到40ml的玻璃瓶中。洗脫液用氮氣吹干，最后加入2ml丙酮定容，丙酮中含有3種保護劑(3-ethoxy-1,2-propanediolat10g/L;andD-sorbitolandL-gulonicacidc-lactoneat1g/L;respectively).三種保護劑混合的使用可以彌補基質(zhì)效應(yīng)。戊唑醇的D6(0.1mg/L)標(biāo)準液作為內(nèi)標(biāo)液也加入，丙酮提取物混勻。最后丙酮提取物放于350μL的玻璃注射器加入2ml的小瓶，用于色譜分析。10葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.5.戊唑醇的分析檢測實際體系中的樣品的測定用氣相-離子阱質(zhì)譜，（其中的進樣方式是PTV，內(nèi)標(biāo)法）模擬體系中的樣品的農(nóng)藥殘留檢測用液相-三級四極質(zhì)譜儀進行測定。（外標(biāo)法）糖的測定用3,5-二硝基水楊酸（DNS）方法，葡萄糖作為標(biāo)準物。乙醇和甘油的測定采用高效液相色譜示差折光檢測器進行檢測。單位微生物量用干重法。11葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.6.模擬試驗中微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵2.6.1.微生物2.6.1.1.(A)酵母的培養(yǎng)2.6.1.2.(B)細菌的培養(yǎng)2.6.2.酒精發(fā)酵試驗三組試驗進行：A'酵母菌在戊唑醇存在的條件下進行培養(yǎng)。B'酵母菌在沒有戊唑醇存在的條件下進行培養(yǎng)。C'在添加戊唑醇條件下未加酵母菌條件下進行。12葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變具有主要葡萄酒特性的簡單培養(yǎng)基用200g/L葡萄糖、7g/L蛋白胨、3.5g/L酵母提取物，通過過濾0.22μm的膜濾器來殺菌。A‘、C’的培養(yǎng)基中戊唑醇的含量是2mg/L。B實驗含有等來量的乙醇。對于三個不同條件下的試驗，將每種配好的溶液平均分成49ml體積的各12份，對于A、B試驗添加1ml的酵母菌液，對于C組試驗添加1ml的滅菌水。所用的盛有樣液的燒杯在20℃and75rpm的震蕩器上培養(yǎng)十三天。每組試驗中的樣本兩兩一組，分別于0,3,4,6,9和13天取出進行單位體積的生物量、還原糖、發(fā)酵代謝物（乙醇、甘油）和戊唑醇的測定。13葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變2.6.3.蘋果酸-乳酸發(fā)酵試驗三組試驗進行：A'酒球菌在戊唑醇存在的條件下進行培養(yǎng)。B'酒球菌在沒有戊唑醇存在的條件下進行培養(yǎng)。C'在添加戊唑醇條件下未加酒球菌條件下進行。和酒精發(fā)酵不同的是戊唑醇的濃度從2mg/L降到0.4mg/L,培養(yǎng)基也改變（1g/L的葡萄糖、7g/L蛋白胨、3.5g/l的酵母提取物、5g/l蘋果酸和80ml/l的乙醇）。其他的和上述酵母菌的相同。

14葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變3、結(jié)果和討論3.1.分析性能本實驗中為了減少基質(zhì)效應(yīng)，在進行農(nóng)藥殘留檢測時溶劑添加分析保護劑（2-乙氧基-1,2-丙二醇、山梨醇、古洛糖酸），同時在進樣時應(yīng)用PTV的進樣方式來減少基質(zhì)效應(yīng)。SLE/SPE/GC–ITMS和SLE/SPE/LC–TQMS的檢測方法的性能通過檢測的線性范圍、精確度、檢測限和定量限繪制的標(biāo)準曲線是戊唑醇面積/內(nèi)標(biāo)物面積的比值對戊唑醇濃度的繪制而成。15葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變16葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變3.2.在葡萄酒加工過程中農(nóng)藥的減少在B試驗中，葡萄先被檢測，確定無戊唑醇的殘留，當(dāng)葡萄去梗破碎之后，添加3.3mg/kg的戊唑醇的標(biāo)品，本文選擇這個濃度一是為了便于檢測到戊唑醇產(chǎn)生的降解物，第二使用純品是為了防止商品農(nóng)藥中其他雜質(zhì)的影響。加入標(biāo)準戊唑醇農(nóng)藥后一天，發(fā)酵正式開始，根據(jù)上表中的要求進行取樣，在B試驗中戊唑醇殘留的量如表2，在試驗A組中戊唑醇的量一直未檢出。17葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變18葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變根據(jù)A組和B組葡萄酒釀造過程中葡萄汁密度大小的比較，基本相同，時間周期在10–15天。為此可以的出這樣的結(jié)論：酵母的發(fā)酵作用未收到農(nóng)藥戊唑醇的顯著影響。浸泡酒精發(fā)酵階段是戊唑醇存在于酒還是酒渣的關(guān)鍵階段，從開始的未發(fā)酵的葡萄汁到浸泡酒精發(fā)酵階段的最后，戊唑醇分布于液相部分的葡萄汁和固相部分的葡萄渣，戊唑醇沒有完全溶解于液相部分這是由于它的水溶性（0.032g/L),從表2可以看出在酒中的農(nóng)藥殘留只有12%，而葡萄酒渣中的農(nóng)藥殘留占到88%，表明戊唑醇對懸浮于液相中的固體顆粒有很強的親和性。19葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變對于蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中，戊唑醇對酒球菌具有抗分解的性質(zhì)，和酒精發(fā)酵結(jié)束時戊唑醇（0.6mg/L)的濃度相當(dāng)。對于澄清過程，使用卵清蛋白，它可以除去大量的多酚物質(zhì)，從使就具有較好的口感。經(jīng)過這個過程，農(nóng)殘除去大約25%。對于物戊唑醇的降解產(chǎn)物，由于沒有降解產(chǎn)物檢出，所以降解過程沒有寫到，文章寫到為了進一步確定戊唑醇是否產(chǎn)生降解產(chǎn)物，需要做模擬試驗（invitroassays）來確定戊唑醇是降解了還是吸附到了固體介質(zhì)上。20葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變從上面得出的結(jié)果可以說明在葡萄酒的加工過程中，戊唑醇表現(xiàn)出連續(xù)的減少。3.3.模擬試驗結(jié)果盡管用實際釀造葡萄的試驗可以有農(nóng)藥殘留濃度對微生物的影響，但是由于有固體物質(zhì)對農(nóng)藥的吸附以及在進行單位生物量的測定，這些固體物質(zhì)的存在都會影響測定結(jié)果，同時由于真正體系物質(zhì)的復(fù)雜導(dǎo)致對戊唑醇的降解產(chǎn)物的檢測定性、定量有很大影響。模擬真正發(fā)酵體系的性質(zhì)，配置的液體培養(yǎng)基來評價戊唑醇對發(fā)酵參數(shù)的影響。21葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變3.3.1.戊唑醇對酒精發(fā)酵的影響22葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變23葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變圖標(biāo)解析：在模擬體系中2mg/L的戊唑醇的殘留量導(dǎo)致糖消耗率的減少，酵母生長緩慢，酒精產(chǎn)生緩慢，同時由于戊唑醇的存在使酵母的最大生物量也降低了。可見戊唑醇的存在對酵母具有毒害效果。酵母的代謝物甘油影響不大，但是酒精的產(chǎn)生速度減慢。和不添加農(nóng)藥的相比，添加農(nóng)藥的這組的酒精的最大產(chǎn)生量晚了4-5天。添加農(nóng)藥的一組最后的酒精的最大濃度高于不加農(nóng)藥的一組，這是由于添加不加農(nóng)藥這組的糖在發(fā)酵開始階段已經(jīng)消耗了。24葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變雖說戊唑醇的殘留對酵母有毒害作用，導(dǎo)致單位最大生物量和發(fā)酵速度的減緩，然而，對于真正的釀酒體系溶于葡萄汁的戊唑醇有一部分會吸附到懸浮于液相的固體顆粒上，所以溶液中真正的液體農(nóng)殘濃度很低，對酵母發(fā)酵的影響很小了。本試驗為了研究農(nóng)藥的減少不僅由于固體物質(zhì)的吸附而且還有酵母菌的吸附作用，在發(fā)酵過程中不僅對游離于液體中的戊唑醇進行檢測，同時對吸附于酵母上的農(nóng)藥殘留量也進行了檢測。結(jié)果顯示可溶性的戊唑醇的量未發(fā)生變化，酵母菌上面吸附的戊唑醇的含量不顯著。同時戊唑醇的降解產(chǎn)物未檢出，可知酵母菌在葡萄汁發(fā)酵過程中不會對戊唑醇產(chǎn)生降解作用。25葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變26葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變3.3.2.蘋果酸乳酸發(fā)酵的影響27葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變28葡萄酒在釀造過程中戊唑醇的演變結(jié)果表明0.6mg/L的戊唑醇的殘留對蘋果酸轉(zhuǎn)化成乳酸的影響不顯著。兩種酸的最終濃度基本相同。和酵母菌一樣，酒球菌的存在對戊唑醇的降解產(chǎn)物未檢出。29葡