微生物學(xué)報(bào)ActaMicrobiologicaSinica2023,63(7):2534–2551/actamicrocnDOI:10.13343/ki.wsxb.20220798ReviewReview綜述裂解性多糖單加氧酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展宋曉菲1*，馮超2*1浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州3100142浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310000宋曉菲宋曉菲,馮超.裂解性多糖單加氧酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào),2023,63(7):2534-2551.SONGXiaofei,FENGChao.Lyticpolysaccharidemonooxygenaseanditsapplication[J].ActaMicrobiologicaSinica,2023,63(7):2534-2551.摘要：裂解多糖單加氧酶(lyticpolysaccharidemonooxygenases,LPMOs)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的氧化酶，該酶在生物質(zhì)酶解方面發(fā)揮著重要的作用，因此，被描述為生物質(zhì)解構(gòu)助推器。LPMOs與底物的結(jié)合具有特異性，催化機(jī)理尚未完全闡明。雖然關(guān)于LPMOs的研究很多，但真正投入到工業(yè)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的卻很少，這對(duì)它們的表達(dá)、調(diào)控和應(yīng)用都提出了挑戰(zhàn)。本文首先系統(tǒng)綜述了LPMOs的發(fā)現(xiàn)與分類(lèi)、催化機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系，其次探討了LPMOs的活性測(cè)定方法及重組表達(dá)技術(shù)，最后協(xié)同綜述了LPMOs在不同領(lǐng)域的應(yīng)用并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。本綜述有助于加深對(duì)LPMOs的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，推動(dòng)LPMOs及其酶工程的研究，以期為L(zhǎng)PMOs的研究和應(yīng)用提供關(guān)鍵詞：裂解多糖單加氧酶；生物質(zhì)轉(zhuǎn)化；生物催化；生物能源；納米纖維資助項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金(LQ22C050004)；國(guó)家自然科學(xué)基金(32201247)；浙江工業(yè)大學(xué)教學(xué)改革項(xiàng)目(JG2022008)ThisworkwassupportedbytheZhejiangProvincialNaturalScienceFoundation(LQ22C050004),theNationalNaturalScienceFoundationofChina(32201247),andtheTeachingReformProjectofZhejiangUniversityofTechnology(JG2022008).*Correspondingauthors.SONGXiaofei,Tel/Fax:+86-571-88813813,E-mail:xiaofei@;FENGChao,Tel/Fax:+86-571-89972395,E-mail:fengchao11xxwy@163.comReceived:2022-10-24;Accepted:2023-01-11;Publishedonline:2023-01-31宋曉菲等|微生物學(xué)報(bào),2023,63(7)2535LyticpolysaccharidemonooxSONGXiaofei1*,FENGChao2*1CollegeofBiotechnologyandBioengineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,Zhejiang,China2TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou310000,Zhejiang,ChinaAbstract:Lyticpolysaccharidemonooxygenases(LPMOs)arenewlydiscoveredcopperion-dependentoxidases,whichplayanimportantroleintheenzymatichydrolysisofbiomass.Therefore,LPMOshavebeendescribedasbiomassdeconstructionboosters.LPMOsbindtospecificsubstrates,andtheircatalyticmechanismhasnotbeenfullyelucidated.AlthoughtherearemanystudiesinvolvingLPMOs,fewofLPMOshavebeenappliedtoindustrialbiomassconversion,whichposeschallengesfortheirexpression,regulation,andapplication.WecomprehensivelyreviewtherecentadvancesinLPMOsfromtheaspectsofdiscoveryandclassification,catalyticmechanism,andrelationshipbetweenstructureandfunction.Further,wesystematicallysummarizetheactivitydeterminationandrecombinantexpressionmethodsofLPMOs.Finally,weintroducetheapplicationsofLPMOsindifferentfieldsandputforwardthefutureresearchdirections.ThisreviewhelpsdeepenthesystematicunderstandingandpromotetheresearchandengineeringofLPMOs,whichwillprovidereferencefortheapplicationofLPMOs.Keywords:lyticpolysaccharidemonooxygenases;biomassconversion;biocatal生物質(zhì)能作為僅次于煤炭、石油、天然氣的第四大能源，在應(yīng)對(duì)全球氣候變化、環(huán)境污染和能源短缺方面潛力巨大[1]。其中，木質(zhì)纖維素現(xiàn)存量最大，在轉(zhuǎn)化為綠色生物燃料和增值化學(xué)原料方面具有廣闊的應(yīng)用前景，其高值化和資源化利用對(duì)維持全球碳循環(huán)和生物煉制產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要作用[2]，也是我國(guó)“碳達(dá)峰、碳中和”行動(dòng)方案中的重要內(nèi)容。木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化主要包括預(yù)處理、酶解糖化以及發(fā)酵3個(gè)步驟，其中木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化可行性的決定性因素主要是酶解糖化[3]。由此可見(jiàn)，高效纖維素降解酶的創(chuàng)制面向國(guó)家重大需求，具有廣闊的市場(chǎng)前景。如圖1所示，木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中，纖維素是由纖維二糖單元組成的糖鏈通過(guò)氫鍵作用而形成的聚合物，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)制約著纖維素酶促水解的效率。早期的研究以纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,EG)和β-葡糖苷酶(β-glucosidase,BGL)對(duì)纖維素進(jìn)行協(xié)同酶法降解，以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效生物質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。長(zhǎng)期以來(lái)，本課題組致力于纖維素發(fā)酵產(chǎn)醇釀酒酵母菌株的構(gòu)建及工程化改造研究，在釀酒酵母中首創(chuàng)了POT1介導(dǎo)的δ整合方法，利用此方法實(shí)現(xiàn)了CBH在釀酒酵母中的高拷貝、穩(wěn)定表達(dá)，所構(gòu)建菌株SK8-5的酶活性高達(dá)238mU/g，是目前已知報(bào)道的最高酶活[5]；此外還構(gòu)建了一批含有不同纖維素酶比例的適用于不同材質(zhì)纖維素降解的酵母菌株，并從多角度多層次對(duì)菌株進(jìn)行了工程化改造，但研究/actamicrocn2536SONGXiaofeietal.|ActaMicrobiologicaSinica,2023,63(7)Figure1Schematicdiagramoftheroleoflyticpolysaccharidemonooxygenases(LPMOs)inlignocellulosedegradation.發(fā)現(xiàn)制約生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化的瓶頸主要是纖維素的低酶解效率[6]。近幾年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，裂解多糖單加氧酶(lyticpolysaccharidemonooxygenases,LPMOs)可通過(guò)氧化裂解破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，對(duì)纖維素的高效酶解起到重要作用，是極具開(kāi)發(fā)潛力的纖維素降解酶，這一新酶的發(fā)現(xiàn)為木質(zhì)纖維素的酶法降解開(kāi)辟了新的道路[7-9]。本課題組在前期工作中也初步證實(shí)了在TaLPMO的協(xié)同作用下，糖苷水解酶可大幅度提高纖維素的降解效率。因此，本文對(duì)LPMOs的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，包括LPMOs的發(fā)現(xiàn)與分類(lèi)、催化機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系、活性測(cè)定方法、重組表達(dá)技術(shù)及LPMOs在不同領(lǐng)域的應(yīng)用，以期為深入開(kāi)展LPMOs及其生物工程應(yīng)用研究提供指導(dǎo)。1LPMOs的發(fā)現(xiàn)與分類(lèi)LPMOs在自然界中分布廣泛。2008年，Karkehabadi等[10]發(fā)現(xiàn)了糖苷水解酶61(glycosidehydrolase61,GH61)與傳統(tǒng)GH家族之間的結(jié)構(gòu)等[11]證實(shí)GH61家族含有LPMOs，該酶可通過(guò)氧化裂解糖苷鍵。2013年，LPMOs歸類(lèi)于carbohydrate-activeenzymesdatabase(CAZy)數(shù)據(jù)中的輔助活性蛋白家族，LPMOs可實(shí)現(xiàn)難降解多糖的轉(zhuǎn)化，這引起廣大學(xué)者的極大關(guān)注[12]。如表1所示，目前所報(bào)道的AA9家族(之前被稱為GH61)都來(lái)自真菌，具有纖維素裂解活性[10-11,13-31]。AA10家族(之前被歸類(lèi)到CBM33)主要來(lái)源于細(xì)菌和放線菌，具有纖維素裂解活性，少數(shù)具有幾丁質(zhì)裂解活性[30,32-41]。自然界中發(fā)現(xiàn)的AA11和AA13–AA17家族的LPMOs蛋白數(shù)量相對(duì)較少，一般都是從真菌中提取的，這些真菌中的大多數(shù)也能產(chǎn)生降解其他多糖的酶，所以這些菌株可能是新型LPMOs的有趣來(lái)actamicro@,曉菲等|微生物學(xué)報(bào),2023,63(7)2537表1LPMOs的來(lái)源、結(jié)構(gòu)和底物Table1Thesource,structureandsubstrateofLPMOsPcLPMO9DMtLPMO3MtLPMO9L––PhanerochaetechrysosAspergillusnidulansMyceliophthorathermophilaM.thermophilaPASC,AvicelPASC,AvicelPASC,AvicelHiLPMO9BHiLPMO9HNcLPMO9CNcLPMO9DLsAA9ANcLPMO9AHjLPMO9AHjLPMO9BMtLPMO9ABaAA10ABlLPMO10AJdLPMO10ANaLPMO10A–––––––––A.nidulansN.crassaLentinussimilisN.crassaHypocreajecorinaH.jecorinaM.thermophilaBacillusamyloliquefaciensCellvibriojaponicusBacilluslicheniformisJonesiadenitrifcansS.ambofaciensThermobifidafuscaNatrialbaceaearchaCellulose,hemicellulose,Cellulose,xyloglucan,Cellulose,xyloglucan,glucPASCAvicelAoAA11FfAA11–T.fuscaS.coelicolorAspergillusoryzaeFusariumfujikuroiCellulose,chitin,PASC,Avic/actamicrocn2538SONGXiaofeietal.|ActaMicrobiologicaSinica,2023,63(7)AnAA13NcAA13MtAA13AoAA13AtLPMO13AMoLPMO13A–––––AspergillusnidulansN.crassaM.thermophilaA.oryzaeMagnaportheoryzaeAmylose,amylopectin,cornstarAmylose,amylopectin,cornstar BindingtowheatstaPcAA14APcAA14B–PycnoporuscoccineusP.coccineusXylanXylanDmAA15ADmAA15BLmLPMO15-1––––––DrosophilamelanogasterD.melanogasterLocustamigratoriaOstriniafurnacalis– – AaAA16–AspergillusaculeatusPiAA17APiAA17BPiAA17C––Phytophthorainfestans–:Nodata.源[42-53]。還有一些LPMOs的來(lái)源菌株是攻擊植物的病原體[54]，這些菌株中的LPMOs在降解植物多糖中發(fā)揮作用。AA15來(lái)源于熱蠅和黑腹果蠅，參與昆蟲(chóng)多糖的代謝，并影響它們的生理發(fā)育[50-51]。2LPMOs的催化機(jī)制隨著對(duì)LPMOs研究的不斷深入，其催化機(jī)理得到了廣泛的研究，特別是其共底物是O2還是H2O2的問(wèn)題引起了更多的討論。早期的研究發(fā)現(xiàn)，LPMOs的催化過(guò)程依賴于O2的參與。在還原劑作用下，活性中心的Cu2+被還原為Cu+，可以特異性氧化多糖的C1或C4位碳原子，或同時(shí)氧化C1和C4位碳原子[7]。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，未與底物結(jié)合的LPMOs可將O2轉(zhuǎn)化為H2O2[55]，表明H2O2是LPMOs反應(yīng)的首選共底物而不是O2。此外，研究還表明依賴于H2O2的反應(yīng)只需要在初始反應(yīng)時(shí)還原劑為其提供一個(gè)actamicro@,子(圖2A)。為了分析O2和H2O2作為L(zhǎng)PMOs共底物的差異，Hangasky等[56]發(fā)現(xiàn)H2O2依賴的氧化反應(yīng)是非特異性的，而O2依賴的反應(yīng)是區(qū)域選擇性的，但這一說(shuō)法仍然備受爭(zhēng)議。然而，越來(lái)越多的研究證明LPMOs可以利用H2O2作為共底物，其反應(yīng)速率明顯高于O2[57-58]。例如，的活性幾乎比O2反應(yīng)高2個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，研究表明，高濃度的H2O2可以氧化滅活LPMOs，其濃度對(duì)LPMOs活性影響較大[59-60]，而當(dāng)LPMOs與底物結(jié)合時(shí)，其失活的可能性要低得多[59]。2O2在LPMOs催化作用中起著關(guān)鍵作用，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。LPMOs通過(guò)氧化裂解糖苷鍵，根據(jù)氧化位點(diǎn)的不同可將其分為L(zhǎng)PMO-1、LPMO-2和LPMO-3，它們不同氧化位點(diǎn)的機(jī)理引起了研究者們的廣泛關(guān)注。如圖2B所示，LPMO-1僅氧化多糖的C1位置，產(chǎn)生內(nèi)酯產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化為醛宋曉菲等|微生物學(xué)報(bào),2023,63(7)2539圖2LPMOs的催化機(jī)制Figure2CatalyticmechanismofLPMOs.A:ThereactionschemesforLPMOs.B:OverviewofLPMOswithC1and/orC4oxidations.S:Polysaccharidesubstrate.糖酸。LPMO-2只氧化多糖的C4位置，生成4-酮醛糖，酮醛糖水合生成偕二醇。LPMO-3氧化多糖的C1和C4位置，生成醛糖酸和4-酮醛糖[23,61]。此外，近期研究還發(fā)現(xiàn)部分LPMOs可以氧化C6位，并不裂解糖苷鍵[62-63]。結(jié)果表明，LPMOs與底物結(jié)合的芳香族氨基酸對(duì)其區(qū)域選擇性影響較大[64]。例如，Danneels等[65]將來(lái)自于紅褐肉座菌LPMO9A的Tyr24和Tyr211殘基突變?yōu)锳la，發(fā)現(xiàn)Y24A增強(qiáng)了C1氧化，對(duì)C4氧化變化不大，而Y211A增強(qiáng)了C4氧化，減弱了C1氧化，其他研究報(bào)告也證實(shí)了類(lèi)約有12個(gè)氨基酸在LPMO的C4氧化中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步的突變研究正在進(jìn)行中。令人驚訝的是，目前報(bào)道的AA10家族要么有C1氧化位點(diǎn)，要么同時(shí)有C1和C4氧化位點(diǎn)，但未單獨(dú)發(fā)現(xiàn)C4氧化位點(diǎn)，這可能是由活性位點(diǎn)銅與配體在軸向位置上的可達(dá)程度影響的[66]。由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有限，目前只對(duì)其催化機(jī)理進(jìn)行了初步研究，不同LPMOs的區(qū)域選擇性可通過(guò)氨基酸突變和缺失來(lái)進(jìn)一步解釋。3LPMOs的結(jié)構(gòu)與功能LPMOs的來(lái)源非常廣泛，但其結(jié)構(gòu)卻有著高度的保守性，目前，LPMOs的晶體結(jié)構(gòu)已被解析[以來(lái)源于嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)/actamicrocn2540SONGXiaofeietal.|ActaMicrobiologicaSinica,2023,63(7)的TaLPMO為例，PDBID：3ZUD，1.25?]，其核心結(jié)構(gòu)呈β三明治，該結(jié)構(gòu)包含10個(gè)典型的β折疊，相鄰的β折疊之間由loop環(huán)相連(圖3A)[11]。2011年，Quinlan等[11]探究了TaLPMO的活性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)由保守的1個(gè)酪氨酸、2個(gè)組氨酸和1個(gè)銅離子組成，其中，第1個(gè)組氨酸被甲基化修飾。銅離子與2個(gè)組氨酸的側(cè)鏈和其中1個(gè)組氨酸的氨基末端的氮原子相連形成一個(gè)“T型”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為組氨酸支架(圖3B)。與一般酶不同的是，LPMOs的活性位點(diǎn)呈平面結(jié)構(gòu)，并不位于深的凹槽或隧道內(nèi)，研究表明，該平面結(jié)構(gòu)的拓?fù)涮卣髋cLPMOs的功能密切相關(guān)[67-68]。為得到具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的LPMO，近年來(lái)，對(duì)LPMO的分子改造越來(lái)越引起人們的關(guān)注，以期獲得高立體選擇性、高活性、強(qiáng)穩(wěn)定性的優(yōu)良生物催化劑。2019年，Jensen等[69]對(duì)來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的LPMO進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析及多序列比對(duì)，通過(guò)篩選理性設(shè)計(jì)的突變體庫(kù)，將具有纖維素催化活性的ScLPMO10C轉(zhuǎn)化為具有幾丁質(zhì)活性的LPMO，表明底物結(jié)合平面結(jié)構(gòu)對(duì)底物特異性的重要作用。2020年，Zhu等[70]對(duì)來(lái)源于海洋細(xì)菌Hahellachejuensis的HcLPMO10進(jìn)行定向進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)位于纖維素結(jié)合模塊(cellulosebindingmodule,CBM)上的N526S位點(diǎn)對(duì)纖維素的催化活性具有重要影響。2020年，Liu等[71]通過(guò)對(duì)來(lái)源于嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophile)MtC1LPMO的loop2進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到了酶活性增加的突變體R17L。4LPMOs的活性分析與測(cè)定與糖苷水解酶相比，LPMOs的催化性能并不能被直接測(cè)定。首先，催化后只有少量的可溶性醛糖酸/酮醛糖低聚物被釋放出來(lái)，而大部分氧化產(chǎn)物與不溶底物仍然保持完整；其次，LPMOs介導(dǎo)的C1和/或C4氧化，由于離子可能來(lái)自同分異構(gòu)體金屬加合物的混合物，因而不容易被質(zhì)譜識(shí)別；最后，LPMOs的氧化能力與氧化后的不溶性多糖底物成正比，但對(duì)不溶性底物的定性和定量分析卻一直是難點(diǎn)。近幾年，有關(guān)LPMOs活性分析與檢測(cè)的方法不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)，研究者們?cè)趥鹘y(tǒng)色譜、質(zhì)譜和快速檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了深入研究和改進(jìn)，這些方法可適用于許多不同的應(yīng)用場(chǎng)景，表2總圖3TaLPMO三維結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)示意圖[11]Figure33DstructureandactivesitediagramofTaLPMO[11].A:3DstructureofTaLPMO.B:“T”histidinescaffolds.actamicro@,曉菲等|微生物學(xué)報(bào),2023,63(7)2541表2LPMOs各種檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)的總結(jié)Table2SummarizedadvantagesanddisadvantagesoftheLPMOsdetectionmethodologiesFeaturesmethodsQualificationorquantificationTargets(soluble/insoluble)StabilityAccuracyAbilityofactivitycomparisonQuickness/ConvenienceMALDI-TOF-MSQualificationSolubleHighHighHighBothSolubleHighHighHighXPSBothInsolubleHighHighHighFluorescentlabellingQuantificationaInsolubleMediumMediumMediumHighIsotopelabellingQuantificationaInsolubleMediumHighHighNickelionsabsorptionQuantificationaInsolubleMediumHighHighViscositychangesQuantificationaN.a.bMediumMediumMediumHighPeroxidaseactivityQuantificationaN.a.bMediumMediumHighHighConfocal/AFMQualificationInsolubleHighMediuma:AcrediblemethodwhichdetecttheLPMO’sproductisnecessarypriortothisassay;b:Notavailable.Thisassaynottargetondetectionofthesolubleorinsolubleoxidationproducts.結(jié)了LPMOs活性測(cè)定方法，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。可溶性產(chǎn)物的檢測(cè)比不溶性產(chǎn)物的檢測(cè)容易。最方便、可靠、快速、有效的方法是基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)，該方法靈敏度極高，可以檢測(cè)微量物質(zhì)，對(duì)LPMOs等活性較低的酶的檢測(cè)效果很好，但缺點(diǎn)也很明顯，即只能進(jìn)行定性分析而不能定量分析；另一方面，由于其靈敏度高，其他酶或污染物很可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，表現(xiàn)為高本底和雜峰的出現(xiàn)，從而更難獲得準(zhǔn)確的質(zhì)譜。此外，高效陰離子色譜(highperformanceanionexchangechromatography,HPAEC)是目前使用最廣泛的C1氧化可溶性產(chǎn)物分析方法，具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。上述方法分析的是LPMOs反應(yīng)過(guò)程中釋放的可溶性寡醛酸產(chǎn)物，而不能分析LPMOs對(duì)不溶性多糖底物的影響。在實(shí)際反應(yīng)中，不溶性產(chǎn)物的比例受多種因素的影響，如反應(yīng)體系的設(shè)置、同一底物的不同形態(tài)(如Avicel和PASC)、底物的濃度等[43,68,72]。X射線光電子能譜分析(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)技術(shù)可用來(lái)檢測(cè)不溶性產(chǎn)物，但XPS的使用成本很高，這極大地限制了它的應(yīng)用。特異性標(biāo)記和氧化位點(diǎn)檢測(cè)是檢測(cè)LPMOs在不溶性底物上氧化效率的主要方法，常用的標(biāo)簽可以是熒光基團(tuán)(fluorescentlabelling)、放射性同位素(isotopelabelling)或其他容易檢測(cè)的基團(tuán)。與熒光或同位素標(biāo)記類(lèi)似，一種更簡(jiǎn)單的方法是基于鎳離子吸附法(nickelionsabsorption)，通過(guò)檢測(cè)羧酸鹽吸附鎳離子所引起的游離鎳離子濃度的差異來(lái)轉(zhuǎn)換LPMOs氧化所引起的羧基數(shù)量[73]。有一些方法并不直接針對(duì)LPMOs反應(yīng)產(chǎn)物，而是通過(guò)間接測(cè)量LPMOs反應(yīng)帶來(lái)的其他參數(shù)的變化來(lái)檢測(cè)LPMOs的活性。Kojima等[26]通過(guò)觀察LPMOs引起的底物動(dòng)態(tài)黏度變化(viscositychanges)來(lái)分析LPMOs的活性，并成功觀察到以葡甘露聚糖、羧甲基纖維素、阿拉伯木聚糖和木糖葡聚糖為底物時(shí)的黏度下降。這種簡(jiǎn)單通用的方法的局限性在于只能測(cè)定可溶性多糖而不能測(cè)定不溶性多糖，特別是纖維素和甲殼素這2種最重要的生物質(zhì)。LPMOs在/actamicrocn2542SONGXiaofeietal.|ActaMicrobiologicaSinica,2023,63(7)O2存在時(shí)被還原生成H2O2，溶液中的H2O2可被檢測(cè)到，因此，研究者們成功開(kāi)發(fā)了基于LPMOs過(guò)氧化物酶活性(peroxidaseactivity)的測(cè)定方法。除了上述直接或間接的分析方法外，通過(guò)成像方法觀察LPMOs催化過(guò)程中底物的微觀形態(tài)變化也可以作為定性分析的手段。研究表明，經(jīng)過(guò)LPMOs處理和熒光染色后，纖維素底物在激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)出透射和熒光，而對(duì)照組則無(wú)這種現(xiàn)象[74]。該方法適用于LPMOs活性的定性分析。同時(shí)，觀察熒光信號(hào)在襯底上的位置有助于確定LPMOs的選擇性。此外，原子力顯微鏡(atomicforcemicroscopy,AFM)也可用于觀察LPMOs氧化引起的基質(zhì)細(xì)微變化。5LPMOs的異源表達(dá)與調(diào)控LPMOs來(lái)源廣泛，但利用自身來(lái)源菌株發(fā)酵獲得的LPMOs在產(chǎn)量和分離方面存在限制。為了提高LPMOs的生產(chǎn)效率，推進(jìn)其工業(yè)應(yīng)用，在其他宿主中進(jìn)行異源表達(dá)是一種有效的手段。目前，LPMOs主要的表達(dá)宿主是大腸桿菌、芽孢桿菌、畢赤酵母(Pichiapastoris)和一些真菌菌株。由于AA9在起源上都是真菌[74]，大部分AA9在常見(jiàn)的真菌表達(dá)宿主中都有異源表達(dá)，而在細(xì)菌中表達(dá)較少。作為最常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母因其基因操作技術(shù)成熟，已廣泛用于AA9的異源表達(dá)[22,75]?？紤]到AA9的第1個(gè)氨基酸是活性位點(diǎn)，在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，AA9成熟肽的N端可以直接連接到信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，這樣，信號(hào)肽酶就可以正確地裂解得到具有正確N端序列的AA9[26,76]。另一種方法是在質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程中加入合適的酶切割位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶在表達(dá)后對(duì)蛋白進(jìn)行切割，確保第1個(gè)殘基是His[77]。除了畢赤酵母，一些actamicro@,A9也已經(jīng)在其他真菌表達(dá)宿主中重組表達(dá)，如Aspergillusoryzae、M.thermophila、T.reesei、A.nidulans、Penicilliumverruculosum[29-30,42,44,78]，但可能存在轉(zhuǎn)化和操作困難等問(wèn)題。在這些真菌表達(dá)宿主中表達(dá)的AA9的N端殘基His被甲基化[11,60,79]，這使得AA9更能抵抗H2O2引起的氧化失活[60]。因此，甲基化修飾N端組氨酸可以提高AA9的穩(wěn)定性，對(duì)其工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。為了提高AA9的生產(chǎn)效率，在真菌表達(dá)宿主中，已經(jīng)有多種信號(hào)肽用于分泌表達(dá)AA9。當(dāng)以畢赤酵母為宿主時(shí)，α-因子信號(hào)肽[76-77,80]和AA9的原生信號(hào)肽[75,81]是最常用的信號(hào)肽。例如，Ladevèze等[82]在畢赤酵母中使用了原生信號(hào)肽和α因子信號(hào)肽表達(dá)3種蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，GcLPMO9A和GcLPMO9B利用其原生信號(hào)肽獲得的蛋白產(chǎn)量要高于α-因子信號(hào)肽，而GcLPMO9C使用α-因子信號(hào)肽獲得更高的蛋白產(chǎn)量。然而，使用原生信號(hào)肽的3種酶的比活性都高于α因子信號(hào)肽，這是因?yàn)槭褂迷盘?hào)肽分泌的LPMOs具有更多正確的N端His[82]。Kadowaki等[83]在米曲菌中使用2種信號(hào)肽(原生信號(hào)肽和pEXPYR載體上的糖淀粉酶信號(hào)肽)表達(dá)MtLPMO9J，發(fā)現(xiàn)只有原生信號(hào)肽能夠成功分泌具有正確N端His的MtLPMO9J。綜上所述，當(dāng)AA9在真菌中分泌表達(dá)時(shí)，與其他信號(hào)肽相比，使用其自身信號(hào)肽分泌的N端正確重組蛋白會(huì)更多。然而，在真菌表達(dá)宿主中優(yōu)化AA9信號(hào)肽的研究并不多，因此，可以利用不同的信號(hào)肽進(jìn)一步提高AA9的生產(chǎn)效率，信號(hào)肽與LPMOs的構(gòu)象關(guān)系也非常值得研究。除了上述真菌表達(dá)宿主外，LPMOs也在大腸桿菌和芽孢桿菌中進(jìn)行了表達(dá)嘗試，但在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，大多出現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)。例如de宋曉菲等|微生物學(xué)報(bào),2023,63(7)2543Gouvêa等[84]在大腸桿菌中異源表達(dá)Aspergillusfumigatus衍生的AfAA9B基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AfAA9B形成了包涵體。用載體pET-21a去除其原有信號(hào)肽后，實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的胞內(nèi)可溶性表達(dá)[85-86]。此外，Guo等[87]在大腸桿菌和解淀粉芽孢桿菌中成功分泌MtC1LPMO，發(fā)現(xiàn)不同的信號(hào)肽對(duì)其分泌水平有不同的影響。然而，在大腸桿菌和解淀粉桿菌中表達(dá)的MtC1LPMO的比活性低于畢赤酵母，這可能是由于畢赤酵母對(duì)該蛋白進(jìn)行了糖基化[88]，但當(dāng)前文獻(xiàn)中缺乏糖基化對(duì)LPMOs活性影響的系統(tǒng)研究[89]。AA10大多來(lái)源于細(xì)菌，因此AA10主要在芽孢桿菌和大腸桿菌中異源表達(dá)[90]。當(dāng)AA10在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，大部分AA10可以通過(guò)信號(hào)肽到達(dá)周質(zhì)空間[34,37,91]，然后正確斷開(kāi)，保留蛋白質(zhì)N端的His殘基。一些AA10使用其原生信號(hào)肽表達(dá)[34]，一些使用來(lái)自其他蛋白質(zhì)的信號(hào)肽[92]，不同的信號(hào)肽對(duì)AA10的表達(dá)效率影響不同。Courtade等[92]比較了不同AA10的信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)SmAA10A(CBP21)的信號(hào)肽優(yōu)于其他5種蛋白的信號(hào)肽。同時(shí)，信號(hào)肽SmAA10A可以實(shí)現(xiàn)多種蛋白的高效表達(dá)[93]。然而，通過(guò)比較12種不同的信號(hào)肽和SmAA10A的原生信號(hào)肽，Yang等[91]發(fā)現(xiàn)pelB是提高SmAA10A產(chǎn)量的最有效信號(hào)肽。許多不同來(lái)源的AA10也可以用pelB成功表達(dá)[37,41]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道AA10在無(wú)信號(hào)肽時(shí)可以在大腸桿菌中成功表達(dá)[94-96]，并通過(guò)避免分泌到周質(zhì)空間來(lái)提高產(chǎn)量[96]。要獲得有活性的AA10，需要在其第1個(gè)His殘基前面插入一個(gè)酶裂解位點(diǎn)。比如Gregory等[96]使用pET-SUMO載體表達(dá)BaAA10(來(lái)源于Bacillusamyloliquefaciens)，將成熟肽置于載體SUMO蛋白酶裂解位點(diǎn)后面。除了大腸桿菌外，一些AA10也被克隆并在芽孢桿菌宿主中表達(dá)[97]。當(dāng)在芽孢桿菌表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)可直接被分泌到胞外培養(yǎng)基中，進(jìn)而可減少下游分離和純化的成本[98]。相比于大腸桿菌復(fù)雜的周質(zhì)分離，利用芽孢桿菌表達(dá)蛋白的純化過(guò)程更為簡(jiǎn)單。例如，Yu等[97]使用枯草芽孢桿菌表達(dá)BatLPMO10時(shí)，蛋白產(chǎn)量比大腸桿菌高3.7倍。然而，與大腸桿菌相比，芽孢桿菌中的質(zhì)粒穩(wěn)定性較差，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體制備困難，實(shí)驗(yàn)操作性較差[99]。與在畢赤酵母中不同，當(dāng)使用非原生信號(hào)肽時(shí)，LPMO在大腸桿菌或芽孢桿菌中的表達(dá)更有效[87,91-92,100]。此外，還有個(gè)別的AA10在其他宿主中異源表達(dá)，如Thermobifidafusca中的TfAA10A可以在Synechococcuselongatus中進(jìn)行表達(dá)[101]。除AA9和AA10外，目前鑒定的AA11和AA13–AA17數(shù)量較少，它們?cè)诓煌拗髦幸泊嬖诋愒幢磉_(dá)。從源菌株中克隆的AA11[42-43]和AA17[53]，也實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。AA13部分在源菌株中表達(dá)[44]，還有一些克隆并在其他真菌中表達(dá)[45-46]。AA14和AA16分別利用其原生信號(hào)肽在畢赤酵母中成功表達(dá)[49,52]。此外，AA15也成功實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)[50-51]。綜上所述，總結(jié)LPMOs各家族的異源表達(dá)，主要表達(dá)宿主為大腸桿菌和畢赤酵母。不難發(fā)現(xiàn)，從真菌中獲得的AA9更適合在畢赤酵母中表達(dá)，產(chǎn)率也高于大腸桿菌。相比之下，AA10主要來(lái)源于細(xì)菌，在大腸桿菌中的表達(dá)更為成功。AA11、AA13、AA14、AA16和AA17都來(lái)自真菌，尚未發(fā)現(xiàn)相對(duì)較優(yōu)的首選表達(dá)宿主。目前對(duì)AA11和AA17的研究數(shù)據(jù)表明，它們只在大腸桿菌中進(jìn)行過(guò)異源表達(dá)，可能是由于對(duì)它們的研究較少的緣故。因此，隨著越來(lái)越多LPMOs的發(fā)現(xiàn)，LPMOs對(duì)表達(dá)宿主的偏好性是非常值得系統(tǒng)研究的領(lǐng)域。/actamicrocn2544SONGXiaofeietal.|ActaMicrobiologicaSinica,2023,63(7)6.1LPMOs在生物能源方面的應(yīng)用木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)能作為可再生碳源，是僅次于煤炭、石油、天然氣的第四大能源，它的開(kāi)發(fā)利用是應(yīng)對(duì)全球氣候變化、能源短缺和環(huán)境污染最有潛力的解決方案之一。木質(zhì)纖維素具有“生物質(zhì)抗降解屏障”的特征[102]，因此，經(jīng)濟(jì)高效的木質(zhì)纖維素降解酶系統(tǒng)開(kāi)發(fā)是解決問(wèn)題的關(guān)鍵，這也是制備纖維素乙醇等生物能源的基礎(chǔ)。由于木質(zhì)纖維素組分與結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性和多樣性，其充分降解依賴多種纖維素酶與輔酶的協(xié)同作用，然而，受限于傳統(tǒng)水解酶降解復(fù)雜結(jié)晶多糖的低效率，這些生物質(zhì)資源還不能被有效利用。2010年，LPMOs的發(fā)現(xiàn)為突破木質(zhì)纖維素糖化瓶頸帶來(lái)重大機(jī)遇。LPMOs的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，將為降低農(nóng)林廢棄物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的用酶成本、促進(jìn)低碳綠色纖維素高值化利用做出重要貢獻(xiàn)。6.2LPMOs在納米纖維方面的應(yīng)用納米纖維素在自然界中的含量非常豐富，是一種極具發(fā)展前景的納米材料。納米纖維素具有許多優(yōu)異的特性，如出色的機(jī)械性能、可調(diào)節(jié)的表面化學(xué)性質(zhì)、低毒性、可生物降解性和生物相容性等。納米纖維素可應(yīng)用于藥物輸送、傷口敷料、組織工程支架等[103]，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，LPMOs可削弱纖維內(nèi)聚力，促進(jìn)纖維斷裂，同時(shí)保持纖維素的結(jié)晶度，可用于處理纖維素纖維，以制備納米級(jí)纖維素。相比于傳統(tǒng)的納米纖維制備方法，該過(guò)程低耗能、低毒性，具有制備纖維素納米材料的綠色潛力[104]。6.3LPMOs在植物防御方面的應(yīng)用LPMOs是存在于真菌、細(xì)菌和病毒中的銅依賴性酶，對(duì)植物的感染以及降解植物體中纖維素發(fā)揮至關(guān)重要的作用。自從發(fā)現(xiàn)以來(lái)，LPMOs在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。最近在真菌和卵菌綱(AA16)以及昆蟲(chóng)(AA15)中發(fā)現(xiàn)了其他LPMOs家族，表明LPMOs可能還參與了其他生物過(guò)程，例如克服植物防御。美國(guó)俄克拉荷馬州立大學(xué)AndrewJ.Mort教授在權(quán)威期刊TrendsinPlantScience發(fā)表了綜述論文，Dolyticpolysaccharidemonooxygenasesaidinplantpathogenesisandherbivory?從植物防御的角度全面概述不同的LPMOs家族的潛在作用，以及它們?cè)谥贫ㄐ碌牟呗砸詫?shí)現(xiàn)對(duì)植物病原菌和蟲(chóng)害的保護(hù)方面的多重意義[54]。LPMOs通過(guò)氧化裂解破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)松散，為糖苷水解酶提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)纖維素的高效酶解起到重要作用，是極具開(kāi)發(fā)潛力的纖維素降解酶。NOVOZYME是世界上最好的酶制造商之一，最近升級(jí)了其商業(yè)纖維素降解酶，其中就包括LPMOs[4]。然而，LPMOs從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模生物煉制產(chǎn)業(yè)的可擴(kuò)展應(yīng)用仍然存在諸多問(wèn)題和關(guān)鍵挑戰(zhàn)。例如，LPMOs的催化機(jī)制尚不明確，重組LPMOs的產(chǎn)量還不適用于實(shí)際的生物煉制工藝，目前高活力和強(qiáng)穩(wěn)定性兼?zhèn)涞腖PMOs仍然稀缺等等，這都成為L(zhǎng)PMOs在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用的重要瓶頸。因此，未來(lái)的研究應(yīng)該著力于解決這些關(guān)鍵問(wèn)題和挑戰(zhàn)，以促進(jìn)木質(zhì)纖維素在維持全球碳循環(huán)和生物煉制產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的高值化和資源化應(yīng)用。參考文獻(xiàn)[1]WAREINGTC,GENTILEP,PHANAN.Biomass-basedcarbondots:currentdevelopmentandactamicro@,曉菲等|微生物學(xué)報(bào),2023,63(7)2545futureperspectives[J].ACSNano,2021,15(10):15471-15501.[2]RESHMYR,PHILIPE,MADHAVANA,SIROHIR,PUGAZHENDHIA,BINODP,KUMAVIVEKN,KUMARV,SINDHUR.Lignocelluloseinfuturebiorefineries:strategiesforcost-effectiveproductionofbiomaterialsandbioenergy[J].BioresourceTechnology,2022,344:126241.[3]SHARMAJ,KUMARV,PRASADR,GAURNA.EngineeringofSaccharomycescerevisiaeasaconsolidatedbioprocessinghosttoproducecellulosicethanol:recentadvancementsandcurrentchallenges[J].BiotechnologyAdvances,2022,56:107925.[4]RANISINGHANIAR,DIXITP,KUMARPATELA,SHEKHERGIRIB,KUOCH,CHENCW,DONGCD.Roleandsignificanceoflyticpolysaccharidemonooxygenases(LPMOs)inlignocellulosedeconstruction[J].BioresourceTechnology,2021,335:125261.[5]SONGXF,LIUQL,MAOJW,WUYZ,K,ZHANGXM,BAIYL,XUHJ,QIAOMQ.POT1-mediatedδ-integrationstrategyforhigh-copy,stableexpressionofheterologousproteinsinSaccharomycescerevisiae[J].FEMSYeastResearch,2017,17(6):fox064.[6]SONGXF,LIYZ,WUYZ,CAIM,LIUQL,GAOK,ZHANGXM,BAIYL,XUHJ,QIAOMQ.MetabolicengineeringstrategiesforimprovementofethanolproductionincellulolyticSaccharomycescerevisiae[J].FEMSYeastResearch,2018,18(8):foy090.[7]VAAJE-KOLSTADG,WESTERENGB,HORNSJ,LIUZL,ZHAIH,S?RLIEM,EIJSINKVGH.Anoxidativeenzymeboostingtheenzymaticconversionofrecalcitrantpolysaccharides[J].Science,2010,330(6001):219-222.[8]ARFIY,SHAMSHOUMM,ROGACHEVI,PELEGY,BAYEREA.Integrationofbacteriallyticpolysaccharidemonooxygenasesintodesignercellulosomespromotesenhancedcellulosedegradation[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014,111(25):9109-9114.[9]BISSAROB,KOMMEDALE,R?HR?K,EIJSINKVGH.Controlleddepolymerizationofcellulosebylight-drivenlyticpolysaccharideoxygenases[J].NatureCommunications,2020,11:890.[10]KARKEHABADIS,HANSSONH,KIMS,PIENSK,MITCHINSONC,SANDGRENM.Thefirststructureofaglycosidehydrolasefamily61member,Cel61BfromHypocreajecorina,at1.6Aresolution[J].JournalofMolecularBiology,2008,383(1):144-154.[11]QUINLANRJ,SWEENEYMD,LOLEGGIOL,OTTENH,POULSENJCN,JOHANSENKS,KROGHKBRM,J?RGENSENCI,TOVBORGM,ANTHONSENA,TRYFONAT,WALTERCP,DUPREEP,XUF,DAVIESGJ,WALTONPH.Insightsintotheoxidativedegradationofce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