目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解第三節(jié)重組子的篩選在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細(xì)胞背景中篩選出期待的克隆子。概念克隆子轉(zhuǎn)化子重組子2目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解將攝取外源DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱為克隆子。把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子（導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子），現(xiàn)在這兩者有通用的趨向。含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽(yáng)性克隆子或期望重組子

。經(jīng)過(guò)各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽(yáng)性克隆子的過(guò)程稱為克隆子的篩選。

3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解一、遺傳表型直接篩選法（一）根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，通常在載體DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標(biāo)記基因，在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。4目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解

一般的做法是:將轉(zhuǎn)化處理后的受體細(xì)胞接種在含適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長(zhǎng)溫度條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況挑選出轉(zhuǎn)化子。5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解常用的選擇標(biāo)記基因主要是：抗性基因；

表達(dá)產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因相應(yīng)的選擇條件是：可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素；可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑。6目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解選擇培養(yǎng)基是：根據(jù)宿主細(xì)胞類(lèi)型配置的培養(yǎng)基，對(duì)于細(xì)菌受體細(xì)胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。選擇物：是由載體DNA分子上攜帶的選擇標(biāo)記基因所決定。7目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（一）根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子（1）抗藥性篩選（2）插入失活篩選法（3）插入表達(dá)篩選法（4）顯色互補(bǔ)篩選法（5）利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞（6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞8目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（1）抗藥性篩選9目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解10目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解正向選擇方式11目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解注意：利用含一種選擇藥物的選擇培養(yǎng)基無(wú)法區(qū)分重組子和非重組子，只能區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子。非轉(zhuǎn)化子呈Aps、Tcs轉(zhuǎn)化子呈Apr、Tcr/s12目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（2）插入失活篩選法13目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解雙抗藥性篩選雙14目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解15目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（3）插入表達(dá)篩選法利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標(biāo)記基因的表達(dá)，由此進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。有些載體在設(shè)計(jì)時(shí)，在篩選標(biāo)記基因前面連接上一段負(fù)調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時(shí)，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)。16目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解例如pTR262質(zhì)粒載體，它由pBR322衍生而來(lái)，其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌體DNA的CI阻遏蛋白編碼基因及其調(diào)控序列，CI基因表達(dá)的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表達(dá)。當(dāng)外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglⅠ位點(diǎn)上時(shí)，CI基因失活。Tcr基因因阻礙解除而得以表達(dá)，故陽(yáng)性重組子為T(mén)cr表型。

質(zhì)粒本身因?yàn)門(mén)cr基因受阻礙為T(mén)cs表型，當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在Tc平板上時(shí)，只有含有外源DNA插入片段的陽(yáng)性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)成菌落。17目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（4）顯色互補(bǔ)篩選法18目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解19目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解lacZ基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這種互補(bǔ)現(xiàn)象稱為α-互補(bǔ)。具有完整乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal時(shí)，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使菌落成為藍(lán)色。如果在載體DNA上組入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．則重組DNA分子轉(zhuǎn)化lacZ’互補(bǔ)型菌落，會(huì)在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色菌落。20目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解lacZ’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lacZ’的重組載體轉(zhuǎn)化lacZ’互補(bǔ)型菌株，可轉(zhuǎn)譯β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基-β-硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子成為藍(lán)色菌落，而lacZ’互補(bǔ)型菌株本身為白色菌落。當(dāng)lacZ’區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化lacZ’互補(bǔ)型菌株，由于不能翻譯β-半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有X－gal和IPTG的培養(yǎng)基上也只能長(zhǎng)成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源基因和不含外源基因的轉(zhuǎn)化子。此方法主要用于原核生物。21目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解

α互補(bǔ)的檢測(cè)22目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解23目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解以顯色劑x-gal作為選擇物時(shí):DNA對(duì)照組不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落；感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照組長(zhǎng)出的菌落應(yīng)全是藍(lán)色的；感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照組長(zhǎng)出的菌落中應(yīng)有白色的。其中一項(xiàng)不符，就有可能挑出假的轉(zhuǎn)化子菌落。24目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（5）利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞報(bào)告基因：系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測(cè)定，常用來(lái)判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類(lèi)特殊用途的基因。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，在有選擇壓力的情況下，可利用報(bào)告基因在受體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從大量非轉(zhuǎn)化克隆中選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞；同時(shí)，報(bào)告基因可以和某些目的基因構(gòu)成嵌合基因，從報(bào)告基因的表達(dá)了解目的基因的表達(dá)情況及推測(cè)基因調(diào)控序列。常用的報(bào)告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類(lèi)或其他持殊產(chǎn)物的基因等。

25目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解特征作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面必須具有以下幾個(gè)條件：

(1)已被克隆和全序列已測(cè)定；

(2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物；

(3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。26目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解①新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素，成為篩選動(dòng)植物轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記基因。②潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，作為選擇標(biāo)記基因主要用于篩選動(dòng)植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)慎重。③氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）也被用于篩選動(dòng)植物轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。27目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解④β-葡萄糖酸酶基因（gus）gus的基因產(chǎn)物β-葡萄糖酸酶（GUS）能夠催化4-甲基傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形花酮，以此篩選含gus基因的轉(zhuǎn)化子。由于植物細(xì)胞GUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。尤其是gus基因的3’端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。28目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解⑤螢火蟲(chóng)熒光素酶基因（luc）luc表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲(chóng)熒光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP底物發(fā)生反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物，經(jīng)過(guò)氧化脫羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測(cè)定儀快速靈敏地檢測(cè)出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報(bào)告基因。Luc基因檢測(cè)十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測(cè)對(duì)人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒(méi)有內(nèi)源熒光產(chǎn)生的背景干擾，因此，Luc是一種理想的報(bào)告基因。29目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解⑥抗除草劑bar基因。bar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），使轉(zhuǎn)化子對(duì)含有磷化麥黃酮（PPT）成分的除草劑具有抗性。⑦冠癭堿合成酶基因。主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚(yú)堿合成基因兩類(lèi)，存在于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段。冠癭堿合成酶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過(guò)電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細(xì)胞的篩選。冠癭堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報(bào)告基因所取代。

30目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。常用的標(biāo)記基因還有：--胸腺核苷激酶基因（tk）、--二氫葉酸還原酶基因（dhfr）--次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt）--細(xì)菌的黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecogpt)等。31目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解胸腺核苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）及次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt）等的表達(dá)產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合成代謝。這些基因缺失的缺陷型細(xì)胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)。如果用這樣的缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞，導(dǎo)入含有上述基因的外源DNA，補(bǔ)充原來(lái)缺失的基因，使核苷酸合成代謝恢復(fù)正常，可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。根據(jù)這一性質(zhì)可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化子。32目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解三、核酸分子雜交檢測(cè)法（p239）基本原理復(fù)性RNADNA33目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解待測(cè)的核酸序列雜交的雙方用于檢測(cè)的已知核酸片段—探針34目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解35目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解

根據(jù)待測(cè)核酸的來(lái)源以及將其分子結(jié)合到固相支持物上的方法的不同。Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點(diǎn)和狹線印跡雜交菌落（或噬菌體）原位雜交核酸分子雜交檢測(cè)法分類(lèi)36目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解又稱DNA印跡雜交、SouthernDNA印跡雜交1、Southern印跡雜交經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段↓轉(zhuǎn)移到濾膜上↓

與標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交↓放射自顯影顯雜交帶基本原理：37目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)?。?）變性解鏈（6）雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析

38目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解毛細(xì)管虹吸印跡法電轉(zhuǎn)移印跡法真空轉(zhuǎn)移法核酸轉(zhuǎn)移（印跡）方法39目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解毛細(xì)管虹吸印跡法濕濾紙高鹽緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖維素膜吸水紙玻璃板支持臺(tái)容器重物40目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解利用核酸分子在電場(chǎng)中的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。濕式電轉(zhuǎn)移干式電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移法41目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極濕式電轉(zhuǎn)移法42目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解真空轉(zhuǎn)移法43目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解真空轉(zhuǎn)移裝置44目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解①硝酸纖維素膜（簡(jiǎn)稱NC膜）優(yōu)點(diǎn)：吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本底低缺點(diǎn)：DNA分子結(jié)合不牢固，膜易碎裂，依賴高鹽溶液常用的固相支持物45目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解②尼龍膜（Nylon）優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比NC膜強(qiáng)，韌性高，可重復(fù)雜交缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高常用的固相支持物46目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解凝膠濾膜轉(zhuǎn)移RNA至膜上RNA分子甲醛變性電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）帶有RNA片段的凝膠轉(zhuǎn)膜雜交、顯影2、Northern印跡雜交47目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解兩種印跡技術(shù)的比較(P248)1\2\3\448目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解3、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交兩種方法的基本原理和操作步驟相同——

即通過(guò)特殊的加樣裝置將變性的DNA或RNA核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上，然后與核酸探針?lè)肿舆M(jìn)行雜交以檢測(cè)核酸樣品中是否存在特異性DNA或RNA。49目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解斑點(diǎn)雜交法50目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解狹縫式點(diǎn)樣器51目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解

1、斑點(diǎn)印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA4、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交的特點(diǎn)52目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解4、菌落（或噬菌斑）原位雜交基本原理直接把菌落和噬菌斑轉(zhuǎn)移到濾膜上溶菌、變性DNA暴露并于濾膜原位結(jié)合與探針雜交53目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解溶菌、使DNA暴露洗菌體碎片和Pr使單鏈DNA牢固結(jié)合在膜上54目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解操作用途Southern印跡雜交從轉(zhuǎn)化子中提取總DNA，經(jīng)酶切、電泳分帶及變性，轉(zhuǎn)移膜上，再用DNA探針與其雜交。操作麻煩。鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有待檢測(cè)重組DNA分子；鑒定待檢測(cè)的DNA分子的大小。斑點(diǎn)印跡雜交把提取的轉(zhuǎn)化子總DNA直接點(diǎn)樣到膜上，變性處理后再用DNA探針與其雜交。操作簡(jiǎn)單。只能區(qū)別總DNA中是否含有待檢測(cè)重組DNA分子的重組子菌落（或噬菌斑）原位雜交直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合，再用DNA探針與其雜交。操作簡(jiǎn)單。廣泛地用于從基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)中篩選含目的基因的重組子。三種篩選方法的比較55目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解雜交探針——指具有一定序列的核苷酸片段，它能與互補(bǔ)的核酸序列復(fù)性雜交，并且通過(guò)適當(dāng)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。5、核酸雜交探針(自學(xué))56目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解①同源或部分同源探針②總cDNA探針③特異性cDNA探針④人工合成的寡核苷酸探針（1）核酸雜交探針的種類(lèi)57目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解理想的探針標(biāo)記物應(yīng)滿足的條件：1)不會(huì)影響探針的主要理化性質(zhì)；2)檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；3)操作簡(jiǎn)便、省時(shí)．經(jīng)濟(jì)實(shí)用：4)化學(xué)穩(wěn)定性高、易于長(zhǎng)期保存；5)安全、無(wú)環(huán)境污染。常用于分子雜交的探針標(biāo)記物分放射性及非放射性。（2）探針標(biāo)記物58目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解放射性標(biāo)記物是指以放射性同位素對(duì)核苷酸等進(jìn)行標(biāo)記后的產(chǎn)物，常見(jiàn)的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最為常用。標(biāo)記物放射性的檢測(cè)主要使用蓋革計(jì)數(shù)器和液體閃爍計(jì)數(shù)器等射線探測(cè)儀來(lái)完成。①放射性標(biāo)記物59目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解非放射性標(biāo)記物的最大優(yōu)勢(shì)是無(wú)放射性污染，分辨力高，穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間保存使用，但與放射性探針相比，多數(shù)非放射性探針的敏感性及特異性較差。目前已廣泛應(yīng)用的非放射性標(biāo)記物有：生物素(biotin)標(biāo)記的核苷酸、地高辛(digoxigenin)標(biāo)記的核苷酸熒光素(fluorescein)標(biāo)記的核苷酸②非放射性標(biāo)記物60目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（3）探針標(biāo)記方法探針的標(biāo)記有體內(nèi)標(biāo)記及體外標(biāo)記兩種方法。體內(nèi)標(biāo)記法是以標(biāo)記化合物作為代謝底物，通過(guò)活體生物或活細(xì)胞的體內(nèi)代謝完成核酸分子標(biāo)記，例如在培養(yǎng)基中加入3H-胸苷，就可以標(biāo)記到生長(zhǎng)在該培養(yǎng)基中的活細(xì)胞DNA分子上。體內(nèi)標(biāo)記法受多種因素的限制，且標(biāo)記活性不高，一般很少使用。61目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解體外標(biāo)記包括化學(xué)法和酶法兩種?；瘜W(xué)標(biāo)記法是利用標(biāo)記物的活性基團(tuán)與核酸分子中的某種基因(如磷酸基團(tuán))發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而直接將標(biāo)記物連接到探針?lè)肿由?，具有?jiǎn)單快速、標(biāo)記均勻的特點(diǎn)，尤其適于制備非放射性標(biāo)記物的探針。酶標(biāo)記法則是先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸上，然后通過(guò)酶促聚合反應(yīng)使帶標(biāo)記的核苷酸摻入到核酸序列中，獲得核酸探針。酶法應(yīng)用廣泛，適于制備所有放射性標(biāo)記探針及部分非放射性標(biāo)記探針。常用的酶法有DNA缺口平移標(biāo)記法、DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法、DNA末端標(biāo)記法及PCR標(biāo)記法等。62目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解①切口平移標(biāo)記法

(nickthanslationlabeling)DNA聚合酶Ⅰ63目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解該法標(biāo)記模板鏈64目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解②隨機(jī)引物標(biāo)記法

(randomprimedDNAlabeling)Klenow片段催化該法標(biāo)記模板互補(bǔ)鏈隨機(jī)引物是含有各種可能排列的寡核苷酸片段的混合物。65目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解隨機(jī)引物：46使用隨機(jī)引物標(biāo)記的探針一般長(zhǎng)400-600個(gè)核苷酸，具多種序列，但都與模板互補(bǔ)。與切口平移法不同的是，該方法標(biāo)記的是模板互補(bǔ)鏈，而非模板本身。66目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解③末端標(biāo)記法

(DNAterminallabeling)該法標(biāo)記的是線性DNA或RNA的5’端或3’端，屬非均一性標(biāo)記。1)3’凸出末端的加尾標(biāo)記法：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將帶有標(biāo)記的dGTP或dCTP加到DNA3’-OH端2)雙鏈DNA3’隱蔽末端的填充標(biāo)記：（若反應(yīng)體系存在全部與模板序列互補(bǔ)的dNTP）以凸出序列為模板，Klenow酶或T4DNA連接酶催化補(bǔ)平3’末端（若一種dNTP帶標(biāo)記則成為探針）。3)5’末端標(biāo)記：T4多聚核苷酸激酶將ATP的標(biāo)記的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到游離的5’-OH上。67目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解④PCR標(biāo)記法(PCRlabeling)：標(biāo)記的一種dNTP⑤光敏標(biāo)記法⑥化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法：生物素和地高辛等非放射性標(biāo)記物可以與事先經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾得到的核酸衍生物更加牢固地結(jié)合，進(jìn)行非放射性探針的制備。常用的化學(xué)修飾反應(yīng)包括磺化、轉(zhuǎn)氨、溴化等反應(yīng)類(lèi)型。⑦交叉相連標(biāo)記法：利用一些高分子化合物，如細(xì)胞色素c、組蛋白H1及大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)等能與核酸結(jié)合的特性，制備相應(yīng)的探針。68目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解四、DNA序列測(cè)定法（錄像）

DNA序列測(cè)定，即核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，簡(jiǎn)稱DNA測(cè)序。對(duì)克隆DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定及分析:可以直觀地鑒定出重組DNA分子中是否含有目的基因;可以獲得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列.這對(duì)目的基因的表達(dá)及其功能研究具有重要意義。69目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解DNA序列分析目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有:Sanger等（1975）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法Maxam和Gilbert（1977）發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。目前Sanger測(cè)序法得到了廣泛的應(yīng)用。70目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解1DNA的化學(xué)降解測(cè)序法DNA的化學(xué)降解測(cè)序法也叫Maxam-Gilbert測(cè)序法基本原理是，將待測(cè)DNA分子進(jìn)行末端放射性標(biāo)記，然后置于4組獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)體系中分別進(jìn)行部分降解，其中每一組反應(yīng)特異性地針對(duì)某一堿基或某一類(lèi)堿基。通過(guò)化學(xué)降解一段時(shí)間后，在每一組反應(yīng)體系中，生成各種不同長(zhǎng)度的、一端為放射性標(biāo)記固定的寡聚核苷酸分子，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影檢測(cè)后可以讀出待測(cè)DNA分子的堿基序列。71目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（2）堿基切割反應(yīng)體系進(jìn)行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)的試劑是硫酸二甲酯、肼（聯(lián)氨）以及哌啶（六氫吡啶）。硫酸二甲酯、肼（聯(lián)氨）——堿基進(jìn)行化學(xué)修飾；哌啶——從修飾堿基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同的組合能特異地切割核苷酸序列中的特定堿基，降解待測(cè)模板DNA分子。72目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解硫酸二甲酯（DMS）：G；pH2甲酸哌啶：

G+A;肼（NH2NH2）：

C+T;肼（NH2NH2）+高鹽：C73目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解1、待測(cè)模板的制備3、待測(cè)模板DNA分子的序列分析2、化學(xué)降解待測(cè)模板DNA分子測(cè)序步驟（3）DNA74目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解序列的讀取是逆電泳方向進(jìn)行的DNA75目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解化學(xué)降解測(cè)序法不僅適于單鏈DNA，也適于雙鏈DNA的測(cè)序，主要用于研究DNA的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)、DNA甲基化位點(diǎn)測(cè)定和DNA-蛋白質(zhì)相互作用等方面，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是DNA測(cè)序的基本方法之一。它的缺點(diǎn)是一輪反應(yīng)所能測(cè)定模板DNA長(zhǎng)度只有250bp左右，若測(cè)定大片段DNA分子時(shí)，操作較為繁瑣費(fèi)時(shí)。另外，化學(xué)降解測(cè)序法不能在載體上直接進(jìn)行，標(biāo)記后的模板DNA分子難以純化。76目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解2DNA的雙脫氧鏈終止測(cè)序法雙脫氧鏈終止測(cè)序法是由Sanger等在加減法的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)單快速的DNA序列分析法，故也稱為Sanger測(cè)序法。有時(shí)又稱為引物合成法，或酶促引物合成法，因?yàn)樵摲ㄊ且源郎y(cè)DNA分子為模板，在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，利用適當(dāng)?shù)腄NA合成引物進(jìn)行DNA互補(bǔ)鏈的合成來(lái)完成測(cè)序工作的。77目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解基本原理：DNA聚合酶能夠利用單鏈DNA作模板，合成出對(duì)應(yīng)的DNA互補(bǔ)鏈，但在反應(yīng)過(guò)程中，如果2’，3’-雙脫氧核糖核苷三磷酸底物（ddNTP）摻入到寡核苷酸鏈的3’端，DNA鏈的延伸反應(yīng)即被終止。ddNTP——鏈終止核苷酸（1）基本原理78目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解79目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解80目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解在4個(gè)特定反應(yīng)體系中分別加入一種ddNTP反應(yīng)底物（ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶I、一定濃度的dNTP（dCTP、dATP、dGTP、dTTP，其中有一種是帶32P放射性標(biāo)記的），DNA鏈的合成隨機(jī)終止于某一特定ddNTPs。最后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影技術(shù)讀出待測(cè)DNA模板的堿基序列。雙脫氧鏈終止測(cè)序法的精確度較高，絕大多數(shù)以單純測(cè)定DNA序列為目的的實(shí)驗(yàn)室均采用此法。此法讀取的堿基序列是待測(cè)DNA模板的互補(bǔ)鏈，而非模板鏈本身。81目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解ddNTP

82目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解83目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解84目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解85目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（2）雙脫氧核糖核苷三磷酸的作用機(jī)制

2’，3’-雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）的分子結(jié)構(gòu)式與2’-脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）極為相似，惟一的區(qū)別是，ddNTP在脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基。在DNA鏈的合成過(guò)程中，ddNTP可以利用其5’-磷酸基團(tuán)與DNA鏈上的游離羥基基團(tuán)形成磷酸二酯鍵而使鏈得以延伸，但是由于ddNTP缺少3’-0H基團(tuán)，不能與下一個(gè)底物分子的5’-磷酸基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，因此新生的寡核酸鏈一旦加入ddNTP，DNA鏈的合成就會(huì)終止。86目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解87目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（3）待測(cè)模板DNA分子的制備限制性核酸內(nèi)切酶消化切割形成DNA小片段↓隨機(jī)地克隆到一種合適的載體分子上↓經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選后得到含有同一來(lái)源DNA片段的重組子克隆后代↓以此大量制備重組DNA分子，直接用于DNA測(cè)序需要采用DNA分子克隆的方法制備模板DNA：88目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解因?yàn)樾律鶧NA鏈的合成反應(yīng)是從引物3’端定向進(jìn)行的，無(wú)須將待測(cè)DNA片段從載體上切下。事實(shí)上，載體的存在不但不會(huì)影響測(cè)序的結(jié)果，反而有利于測(cè)序的進(jìn)行，因?yàn)樵趯?shí)際操作中，引物往往是與載體克隆位點(diǎn)的兩側(cè)序列互補(bǔ)，這樣可以測(cè)定完整的DNA序列。89目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解

M13載體能克隆單鏈DNA分子，制備的產(chǎn)物可直接用作引物合成反應(yīng)中的單鏈模板，同時(shí)，由于待測(cè)DNA片段均被克隆在M13載體的同一個(gè)特定區(qū)段內(nèi)，所有的待測(cè)DNA片段，都可以使用同一種引物，即M13載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)的通用引物（universalprimer）進(jìn)行DNA鏈的合成延伸，避免了因合成和分離各種不同引物而導(dǎo)致的許多麻煩。因此，M13載體雙脫氧鏈終止法目前已經(jīng)成為一種普遍采用的快速DNA序列分析法。90目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解1985年Chen和Seeburg為了提高DNA測(cè)序速度建立。該法是將待測(cè)定的DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上，直接用閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒DNA按雙脫氧鏈終止法測(cè)定模板DNA序列。由于通常使用的質(zhì)粒是PUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析法。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是，它無(wú)須將DNA克隆到M13載體分子上，而是直接用堿變性的雙鏈閉合環(huán)形的重組質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行序列分析，因此比M13法更為簡(jiǎn)單快速，實(shí)用價(jià)值高?！钺槍?duì)雙鏈DNA模板進(jìn)行的雙脫氧鏈終止測(cè)序法91目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（4）測(cè)序反應(yīng)物的合理應(yīng)用雙脫氧鏈終止測(cè)序法的操作關(guān)鍵：是ddNTP與dNTP的用量比例，兩者較為理想的分子比在1：3至1：4之間。大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段、測(cè)序酶（經(jīng)過(guò)改造的T7噬菌體聚合酶）、TaqDNA聚合酶DNA序列分析中通常采用[α-35S］dATP代替[α-32P］dNTP，以便獲得更高的分辨率。92目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解3大片段DNA的測(cè)序策略

DNA測(cè)序通常包括克隆、測(cè)序反應(yīng)和讀序三個(gè)步驟。前述兩種DNA測(cè)序方法中，一次測(cè)序能直接讀出的DNA序列長(zhǎng)度受到聚丙烯酰胺凝膠分離效果的限制，一般情況下，最大限度不超過(guò)350個(gè)堿基序列。因此，對(duì)于較大的DNA片段而言，必須將其分成較小的片段分別測(cè)序，才能獲得完整的堿基序列。

選擇恰當(dāng)?shù)臏y(cè)序策略將直接關(guān)系到大片段DNA或基因組DNA序列分析的工作效率。93目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解①隨機(jī)克隆策略又叫鳥(niǎo)槍法克隆策略，先將克隆DNA片段用超聲波打斷或DNA酶Ⅰ切斷，隨機(jī)亞克隆到M13載體上，分別進(jìn)行DNA序列測(cè)定，然后利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，排出完整的DNA序列。鳥(niǎo)槍法的缺點(diǎn)隨機(jī)亞克隆易造成序列重復(fù)測(cè)定，也易丟失某些序列；測(cè)序及測(cè)序后的數(shù)據(jù)處理和分析工作量大，并需要計(jì)算機(jī)幫助進(jìn)行排序才能得到完整的序列。94目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解95目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解②引物步移策略將待測(cè)DNA片段克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片段的一端開(kāi)始逐步進(jìn)行序列測(cè)定，直到另一端為止。96目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解97目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解引物步移法克服了鳥(niǎo)槍法的盲目性，并省去亞克隆制備的繁瑣步驟，也減輕了隨后數(shù)據(jù)分析的工作量。但由于測(cè)定下一段序列前要預(yù)先知道上游序列的堿基序列，才能合成適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行測(cè)序，因此該策略難以自動(dòng)化操作。此外，引物合成費(fèi)時(shí)費(fèi)力，再加上目前常用的質(zhì)粒載體不易純化等也都影響了該法的實(shí)施。最近的研究表明：隨機(jī)引物可作為引物步移法中的測(cè)序引物，例如采用線性連接的3條6堿基的隨機(jī)引物即可很好地引導(dǎo)測(cè)序反應(yīng)，這些結(jié)果為引物步移法的自動(dòng)化帶來(lái)可能。98目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解③定向缺失克隆策略利用核酸外切酶Ⅲ、Bal31或T4DNA聚合酶等酶解方法，從克隆DNA片段一側(cè)進(jìn)行不同時(shí)間的定向缺失，逐步縮短DNA片段大小，分別回收并環(huán)化DNA缺失片段，使DNA片段被保護(hù)一側(cè)的引物結(jié)合位點(diǎn)與缺失不同長(zhǎng)度的一側(cè)連接重組，轉(zhuǎn)化篩選后得到一系列由待測(cè)DNA片段定向缺失后形成的嵌套重組子，然后利用引物結(jié)合位點(diǎn)逐一測(cè)定這些嵌套重組子中的待測(cè)DNA模板，最后根據(jù)重疊序列將不同片段的序列拼接為完整的DNA片段序列。99目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解利用ExoⅢ能特異性起始切割5’凸出端或平末端的雙鏈DNA，而不能有效切割3’凸出端的雙鏈DNA的特性，構(gòu)建待測(cè)DNA的定向嵌套缺失。100目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解4、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展第一，非放射性標(biāo)記檢測(cè)物的使用第二，DNA測(cè)序自動(dòng)化：1是測(cè)序過(guò)程中某些具體步驟的機(jī)械化和自動(dòng)化，2是高度集成的自動(dòng)化測(cè)序儀的發(fā)明及應(yīng)用第三，計(jì)算機(jī)在DNA測(cè)序中的應(yīng)用：大規(guī)模測(cè)序計(jì)劃在很大程度上依賴于計(jì)算機(jī)程序?qū)υ紨?shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)、整理和排序，尤其是在隨機(jī)測(cè)序策略中，采用計(jì)算機(jī)輔助分析，大大加快了DNA測(cè)序的發(fā)展進(jìn)程。101目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解第四，現(xiàn)有技術(shù)的其他改進(jìn)。主要包括：增加每塊膠上的泳道數(shù)；采用新型凝膠和電泳技術(shù)；改進(jìn)光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)；提高測(cè)序聚合酶的催化效能等。其目的是大大加快測(cè)序速度，提高測(cè)序反應(yīng)的靈敏度及準(zhǔn)確性，降低測(cè)序反應(yīng)對(duì)模板質(zhì)量的要求，簡(jiǎn)化模板制備程序等。102目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解DNA測(cè)序方法分為兩類(lèi)：一類(lèi)是基于凝膠電泳技術(shù)的測(cè)序法，包括目前普遍采用的手工DNA測(cè)序技術(shù)、自動(dòng)化DNA測(cè)序技術(shù)、毛細(xì)管凝膠電泳激光熒光法、陣列毛細(xì)管電泳激光熒光法和超薄層凝膠板電泳激光熒光法等；另一類(lèi)是不依賴于電泳分離的直接測(cè)序法，包括質(zhì)譜法、原子探針?lè)?、雜交法和流動(dòng)式單分子熒光檢測(cè)法等。103目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（1）以凝膠電泳為基礎(chǔ)的測(cè)序方法①DNA全自動(dòng)序列分析系統(tǒng)（ALFsystem）DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。104目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解②超薄層板凝膠電泳（ultra-thingelelectrophoresis，UGE）激光熒光法在電泳方式方面有2處改進(jìn)：1是超高壓電場(chǎng)的使用，它可以大幅度提高電泳速度；2是超薄凝膠的使用，由于降低了凝膠厚度，不僅提高了電泳速度，還可以提高電泳條帶的分辨率，使一次性閱讀由原來(lái)的500個(gè)堿基上升至1000個(gè)堿基，總的效果是測(cè)序速度提高到8000bp／h以上。在電泳結(jié)果檢測(cè)方式方面，以激光熒光檢測(cè)法取代了傳統(tǒng)的放射自顯影檢測(cè)法，既杜絕了放射性核素帶來(lái)的危害，也便于自動(dòng)化操作。105目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解③PCR測(cè)序技術(shù)第一，利用PCR技術(shù)直接從大的DNA片段或基因組DNA中擴(kuò)增獲得足夠量的待測(cè)DNA模板，從而省去亞克隆等繁瑣步驟。目前，不對(duì)稱PCR、單鏈PCR、固相PCR以及循環(huán)PCR等新的PCR技術(shù)都已應(yīng)用到DNA測(cè)序中。第二，通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行重疊群排序。將由重疊群末端序列確定的引物逐一配對(duì)，以待測(cè)大片段DNA為模板進(jìn)行PCR，如能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，便說(shuō)明這兩個(gè)重疊群相鄰。重疊群順序一經(jīng)確定，便可利用PCR擴(kuò)增重疊群間的DNA片段。第三，利用PCR技術(shù)進(jìn)行DNA鏈終止測(cè)序反應(yīng)，這一過(guò)程被稱為循環(huán)測(cè)序。循環(huán)測(cè)序是在模板DNA分子過(guò)少時(shí)，用耐高溫的Taq酶代替DNA聚合酶進(jìn)行酶法測(cè)序。在測(cè)序反應(yīng)中，一方面模板DNA分子得以擴(kuò)增，另一方面ddNTP的插入造成以特定ddNTP結(jié)尾的長(zhǎng)短不同的DNA片段。通過(guò)電泳分離便可獲得待測(cè)DNA分子的堿基序列。循環(huán)測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)有：大大減少了模板DNA的用量；重復(fù)的變性、復(fù)性、鏈延伸循環(huán)可使雙鏈DNA的酶法測(cè)序高效進(jìn)行；初始階段加入試劑后不必在中途補(bǔ)充，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。106目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解

④毛細(xì)管及陣列毛細(xì)管電泳激光熒光法與普通凝膠電泳相比，毛細(xì)管凝膠電泳具備很多優(yōu)勢(shì)：第一，高效、快速。毛細(xì)管內(nèi)徑一般在25～100pm，比表面積大，散熱快，可使用較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，大大提高了分析速度和分辨率。第二，所需樣品量少，靈敏度高。采用電動(dòng)進(jìn)樣或壓力進(jìn)樣，樣品量?jī)H為1-50ul，普通紫外檢測(cè)器可檢測(cè)10-13-10-15mol，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)可達(dá)10-18-10-21mol。第三，在線檢測(cè)。利用檢測(cè)窗口直接進(jìn)行柱檢測(cè)，不受凝膠長(zhǎng)度的影響。第四，操作自動(dòng)化、重復(fù)實(shí)驗(yàn)誤差低。因此，利用毛細(xì)管凝膠電泳進(jìn)行DNA測(cè)序，分辨率極高，其關(guān)鍵在于選擇合適的毛細(xì)管長(zhǎng)度、電場(chǎng)強(qiáng)度、凝膠聚合物濃度及溫度因素等，以達(dá)到將一個(gè)堿基大小差異的DNA片段順利分離開(kāi)來(lái)的目的。107目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（2）非電泳分離的測(cè)序技術(shù)①雜交法（SBH）SBH的基本原理是，用特定長(zhǎng)度的具有所有可能堿基序列的寡核苷酸群體，與未知序列的特點(diǎn)數(shù)目的DNA片段雜交，根據(jù)某些寡核苷酸探針形成的完全雙鏈推知目的DNA的堿基序列。108目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解利用共價(jià)結(jié)合在寡核苷酸3’或5’端的衍生物與玻璃板或凝膠結(jié)合，形成固定的寡核苷酸小區(qū)；不同堿基組合的寡核苷酸小區(qū)排列在一起形成探針點(diǎn)陣，構(gòu)成DNA測(cè)序芯片或稱為基因芯片、寡核苷酸矩陣芯片。芯片中寡核苷酸小區(qū)的數(shù)目取決于寡核苷酸片段的長(zhǎng)度，以八聚體單鏈DNA探針為例，包含所有可能的4種堿基的全部排列序列共計(jì)48=65536種，因此在芯片上寡核苷酸小區(qū)數(shù)目為65536個(gè)，每一個(gè)寡核苷酸小區(qū)則代表了一個(gè)已知序列的探針。每一個(gè)探針序列與其所處位置的對(duì)應(yīng)關(guān)系是已知的，測(cè)序時(shí)，只須將待測(cè)DNA樣品變性解鏈，在單鏈DNA片段末端上共價(jià)標(biāo)記一個(gè)熒光分子，然后與基因芯片進(jìn)行復(fù)性雜交。經(jīng)適當(dāng)清洗后，與探針完全雜交的單鏈DNA的熒光分子在特定波長(zhǎng)的激光束照射下，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的熒光，然后再由熒光掃描儀將基因芯片上的所有方格點(diǎn)陣進(jìn)行熒光掃描檢測(cè)，并將熒光發(fā)射與否的正負(fù)信號(hào)傳輸?shù)诫娔X，最后根據(jù)發(fā)射熒光的探針序列排出待測(cè)DNA樣品的全序列。109目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解110目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解②原子探針顯微鏡法掃描隧道顯微鏡（STM）和原子顯微鏡（AFM）等新技術(shù)的發(fā)展，使快速、高分辨、直接觀測(cè)DNA分子構(gòu)象成為可能。STM采用了相當(dāng)于原子直徑的導(dǎo)電探針掃描樣品表面，通過(guò)連續(xù)測(cè)量移動(dòng)的探頭與分子表面之間形成的隧道電流，確定樣品的三維圖像。AFM則是通過(guò)測(cè)量探針和DNA樣品表面的作用力來(lái)確定分子表面形狀，并不要求樣品導(dǎo)電。目前，應(yīng)用STM已成功地觀測(cè)到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和單個(gè)堿基對(duì)以及單鏈分子中的單個(gè)核苷酸，因此可以直接從DNA單鏈上讀取堿基序列。根據(jù)掃描速度，DNA測(cè)序能力可達(dá)1000bp／min以上。111目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解③流動(dòng)式單分子熒光檢測(cè)法美國(guó)LosAlamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室建立的一種快速DNA測(cè)序新技術(shù)，可對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行檢測(cè)。基本原理是，對(duì)模板DNA片段上的4種堿基分別標(biāo)記上不同的熒光基團(tuán)，然后置于液體系統(tǒng)中，用水流載帶DNA片段流動(dòng)，利用外切酶快速逐個(gè)地切斷DNA中標(biāo)記的單個(gè)堿基，通過(guò)激光熒光檢測(cè)堿基類(lèi)型，便可得到模板DNA序列。據(jù)報(bào)道，此法測(cè)序速度可達(dá)100～1000bp/s，而常規(guī)的自動(dòng)測(cè)序儀最快的閱讀速度僅為0.1bp/s。存在的主要問(wèn)題是如何快速酶切單個(gè)熒光標(biāo)記的核苷酸分子以及如何用4種不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記不同的4種堿基等。112目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解基本過(guò)程與菌落分子雜交法相似，但該法使用抗體探針，而非DNA探針來(lái)鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物。免疫學(xué)檢測(cè)法具有專一性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，只要有一個(gè)拷貝的目的基因在克隆子細(xì)胞內(nèi)表達(dá)合成蛋白質(zhì)，就可以檢測(cè)出來(lái)。前提條件是克隆基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且有目的蛋白的抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)手段的不同，免疫學(xué)檢測(cè)法可以分為抗體測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定法等類(lèi)型。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法（自學(xué)）113目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解（1）放射性抗體測(cè)定法（2）非放射性抗體測(cè)定法1、抗體測(cè)定法114目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解基本依據(jù)一種免疫血清中含有多種類(lèi)型的免疫球蛋白IgG分子，這些IgG分子分別與同一抗原分子上不同的抗原決定簇特異性結(jié)合?？贵w分子或其某部分可牢固地吸附在固體支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不會(huì)被洗脫掉。通過(guò)體外碘化作用，IgG抗體會(huì)迅速地被放射性125I標(biāo)記上。（1）放射性抗體測(cè)定法115目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解放射性抗體測(cè)定法的操作過(guò)程116目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞專業(yè)知識(shí)講解目前所采用的免疫學(xué)檢測(cè)方法中，更多的是先將待檢測(cè)的菌落或噬菌斑按原位印跡到硝酸纖維素膜等固相支持物上，然后裂解細(xì)胞，使目的蛋白抗原結(jié)合到硝酸纖維素膜上，進(jìn)一步與相應(yīng)的抗體（即第一抗體）反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物。對(duì)抗原-抗體復(fù)合物的檢測(cè)，既可采用125I標(biāo)記的第二抗體直接檢測(cè)，也可采用125I標(biāo)記的A蛋白進(jìn)行間接分析。直接檢測(cè)法中，針對(duì)不同的第一抗體，應(yīng)分別標(biāo)記相應(yīng)的第二抗體進(jìn)行檢測(cè)；間接分析法中，只須標(biāo)記一種A蛋白分子便可檢測(cè)多種不同的第一抗體（A蛋白是金黃色葡