專(zhuān)題一基因工程第1頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、DNA重組技術(shù)的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1.分布：2.特點(diǎn)：

特異性，即能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且切割每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，使之?dāng)嚅_(kāi)。主要從原核生物中分離純化出來(lái)第2頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GAA

TTCCTT

AAGGCTTAAGAATTCCCC

GGGGGG

CCCCCCGGGGGGCCC︰︰︰︰︰中軸線︰︰︰︰↓↑EcoRⅠ（在G與A之間切割）SmaⅠ（在G與C之間切割）粘性末端平末端切割DNA分子產(chǎn)生的兩種不同的末端（箭頭表示酶的切割位點(diǎn)）↓↑3.結(jié)果：在識(shí)別序列中軸線兩側(cè)切割，產(chǎn)生粘性末端；在識(shí)別序列中軸線處切割，產(chǎn)生平末端。第3頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（二）DNA連接酶——“分子縫合針”第4頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GCTTAAAATTCG（二）DNA連接酶——“分子縫合針”第5頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）DNA連接酶——“分子縫合針”2.連接酶的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵GCTTAAAATTCG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵1.連接酶的作用：將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來(lái)，使之成為一個(gè)完整的DNA分子第6頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.連接酶的類(lèi)型（按來(lái)源分類(lèi)）(1)E.coliDNA連接酶：(來(lái)源于大腸桿菌)只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端(2)T4

DNA連接酶：（來(lái)源于T4噬菌體）既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端第7頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”1.作用：2.條件：

能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具有多個(gè)限制酶切位點(diǎn),便于目的基因插入；具有標(biāo)記基因，便于篩選；必需是安全的，對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害。

將外源基因送入受體細(xì)胞第8頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.種類(lèi)：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒質(zhì)粒細(xì)菌擬核DNA之外能自主復(fù)制的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子；DNA分子上具有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制；DNA分子上具有特殊的標(biāo)記基因；對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響。第9頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、基因工程的基本操作程序獲取目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因檢測(cè)與鑒定第一步第二步第三步第四步第10頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）目的基因的獲取1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因（1）基因組文庫(kù)

將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。

受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱(chēng)為這種生物的基因組文庫(kù)。（2）部分基因文庫(kù)

受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱(chēng)為這種生物的部分基因文庫(kù)，如cDNA文庫(kù)。第11頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）基因文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫(kù)第12頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)原理

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）,它是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。第13頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第14頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.過(guò)程高溫變性(DNA解旋)（90~95℃）低溫退火(引物結(jié)合)（55~60℃）中溫延伸(互補(bǔ)鏈合成)（70~75℃）

雙鏈DNA是在高溫條件下解鏈為單鏈DNA的，因此整個(gè)過(guò)程不需要解旋酶。多次重復(fù)3.特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增第15頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月推測(cè)推測(cè)合成3.通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。第16頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子，即基因表達(dá)載體。第17頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建第18頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.構(gòu)建目的

使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.構(gòu)建零件及其作用（1）目的基因（2）啟動(dòng)子

RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶與之結(jié)合才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)而獲得需要的蛋白質(zhì)。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建第19頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）終止子

一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。（4）標(biāo)記基因

鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.構(gòu)建零件及其作用(5)

復(fù)制原點(diǎn)第20頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。

基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。

導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑，且因受體細(xì)胞的不同而不同。第21頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.導(dǎo)入植物細(xì)胞（2）其他方法

基因槍法花粉管通道法第22頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月移植顯微注射分裂分化發(fā)育2.導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(顯微注射技術(shù))含目的基因的表達(dá)載體動(dòng)物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動(dòng)物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第23頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.導(dǎo)入微生物細(xì)胞(2)優(yōu)點(diǎn)

繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。(3)常用受體細(xì)胞

大腸桿菌（E.coli）(1)過(guò)程

制備感受態(tài)細(xì)胞：用Ca2+（CaCl2）處理細(xì)菌，使細(xì)菌易于接受外源DNA分子。

重組DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合孵育，完成轉(zhuǎn)化。(Ca2+

處理法)第24頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定

目的基因是否真正插入受體細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過(guò)檢測(cè)、鑒定才能得知。

常用的檢測(cè)手段主要從分子水平和個(gè)體水平進(jìn)行。第25頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月適當(dāng)限制酶切割用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交1.分子水平（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因提取受體生物全部DNA許多DNA片段顯出雜交帶（表明目的基因已插入）（分子雜交技術(shù)）第26頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第27頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA提取受體生物的mRNA用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯出雜交帶（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了mRNA）

檢測(cè)DNA利用的是DNA與DNA雜交，檢測(cè)mRNA利用的是DNA與mRNA雜交。1.分子水平（分子雜交技術(shù)）第28頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)（抗原—抗體雜交技術(shù)）提取受體生物的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體雜交顯出雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）1.分子水平（分子雜交技術(shù)）第29頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.個(gè)體水平例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。第30頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是（）

A.常用相同的限制性?xún)?nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒

B.導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá)

C.DNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶

D.可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒C2.下列關(guān)于基因工程中限制性?xún)?nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是（

）

A.一種限制性?xún)?nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列

B.限制性?xún)?nèi)切酶的活性受溫度的影響

C.限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別和切割RNA

D.限制性?xún)?nèi)切酶可從原核生物中提取C第31頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月含重組質(zhì)粒土壤農(nóng)桿菌抗蟲(chóng)基因含kan質(zhì)粒重組質(zhì)粒A構(gòu)建土壤農(nóng)桿菌導(dǎo)入B培養(yǎng)選擇侵染轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植株離體棉花葉片組織愈傷組織C誘導(dǎo)選擇再生植株分化D檢測(cè)3.在培育轉(zhuǎn)基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作為標(biāo)記基因，只有含卡那霉素抗性基因的細(xì)胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。下圖為獲得抗蟲(chóng)棉的技術(shù)流程。請(qǐng)據(jù)圖回答：（1）A過(guò)程需要的酶有_____________________________________。（2）B過(guò)程及其結(jié)果體現(xiàn)了質(zhì)粒作為運(yùn)載體必須具備的兩個(gè)條件是

__________________________________________________。（3）C過(guò)程的培養(yǎng)基除含有必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、瓊脂和激素外，還必須加入________________。（4）如果利用DNA分子雜交原理對(duì)再生植株進(jìn)行檢測(cè)，D過(guò)程應(yīng)該用

___________________________________________作為探針。限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶具有標(biāo)記基因；能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定保存卡那霉素放射性同位素（或熒光分子）標(biāo)記后的抗蟲(chóng)基因第32頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）科學(xué)家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。①將轉(zhuǎn)基因植株與________________________雜交，其后代中抗卡那霉素型與