第五講基因重組與基因工程RecombinantDNATechniqueandGeneticEngineering

ForGraduateStudentsofVegetableCropsScienceDiscipline2023/7/29IMAU,HuoXW2第一節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組一.接合二.轉(zhuǎn)化三.轉(zhuǎn)導(dǎo)四.轉(zhuǎn)座質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞

通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞獲得新的遺傳表型

病毒把某一細(xì)胞的DNA帶至另一細(xì)胞，使后者獲得新的遺傳表型DNA片段從染色體的某處移位到另一處。2023/7/29IMAU,HuoXW3

重組的類型：位點(diǎn)特異性重組

(site-specificrecombination)2.同源重組（homologousrecombination）五、基因重組(recombinant)不同DNA分子間發(fā)生的共價(jià)連接2023/7/29IMAU,HuoXW41.位點(diǎn)特異性的基因重組

由整合酶催化，重組僅在特定的基因片段和位點(diǎn)上進(jìn)行。

是免疫球蛋白多樣性的分子機(jī)制。2023/7/29IMAU,HuoXW5

同源區(qū)

AaBbBAabBAbaBaAbBb

機(jī)制2.同源重組（homologousrecombination）a

A

功能1.在減數(shù)分裂過程中，同源染色體之間進(jìn)行交換，形成生物個(gè)（群）體的多樣性。2.是DNA損傷修復(fù)的重要機(jī)制之一。2023/7/29IMAU,HuoXW62023/7/29IMAU,HuoXW7第二節(jié)基因工程的工具

——工具酶和載體

2023/7/29IMAU,HuoXW8一、常用的工具酶

(一)限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

---切——基因工程的手術(shù)刀

功能：

識(shí)別雙鏈DNA中特異序列，該序列的特征為4-6個(gè)核苷酸的回文結(jié)構(gòu)，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割DNA，產(chǎn)生粘性末端或平末端。

根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)精確切割雙鏈DNA分子

沒有限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，就很難有今天分子生物學(xué)與基因工程的快速發(fā)展。

2023/7/29IMAU,HuoXW9

作用模式圖：

1.產(chǎn)生5′突出粘性末端(stickyend)

EcoRI

**********GAATTC******************CTTAAG********

5′

3′

5′

3′

*********G

*********CTTAA

5′

3′

3′

5′

—OH

—

P

AATTC*********G*********5′

3′

3′

5′

P

OH—

2023/7/29IMAU,HuoXW10

作用模式圖：

2.產(chǎn)生3′突出粘性末端

PstI

**********CTGCAG************************GACGTC**************5′

3′

5′

3′

5′

3′

3′

5′

—OH

—

P

*********CTGCA

*********G

5′

3′

3′

5′

OH—

—

P

ACGTC***********

G***********

2023/7/29IMAU,HuoXW11

作用模式圖：

3.產(chǎn)生平末端(bluntend)

AluI

*************AGCT**************************TCGA*************5′

3′

5′

3′

5′

3′

3′

5′

—OH

—

P

*************AG*************TC

5′

3′

3′

5′

OH—

—

P

CT*************GA*************2023/7/29IMAU,HuoXW12限制性內(nèi)切酶用途：

基因重組過程中切割DNA以獲取目的基因片段，切割載體形成切口，使目的基因能插入載體中。2.限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphysms,

RFLP)分析：遺傳病的診斷，法醫(yī)DNA指紋分析等。

3.構(gòu)建DNA的物理圖譜，基因定位，DNA的同源性分析等等。2023/7/29IMAU,HuoXW13(二)DNA連接酶(DNAligase)

——基因工程的縫紉針

將兩條雙鏈DNA片段連接起來，實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組。功能：

催化兩條雙鏈DNA分子的互補(bǔ)粘性末端或平末端的5′磷酸基團(tuán)與3′羥基形成磷酸酯鍵。2023/7/29IMAU,HuoXW14

也可將雙鏈DNA分子內(nèi)部的單個(gè)切口(無核苷酸空缺)連接起來。還可作用于RNA，但效率很低。

如需連接單鏈DNA或RNA，則需用RNA連接酶。DNA連接酶催化平末端連接要比粘性末端效率低得多。

2023/7/29IMAU,HuoXW15DNA連接酶

EcoRI

**********GAATTC********************CTTAAG**********5′

3′

5′

3′

*********G

*********CTTAA5′

3′

3′

5′

—OH

—P

AATTC*********G*********5′

3′

3′

5′

—P

OH—

DNA連接酶

作用模式圖：

1.連接粘性末端

2023/7/29IMAU,HuoXW16

作用模式圖：2.連接平末端

AluI

*************AGCT***************************TCGA**************5′

3′

5′

3′

—OH

—P

5′

3′

3′

5′

************TC************AG5′

3′

3′

5′

OH—

—P

CT*************GA*************DNA連接酶

2023/7/29IMAU,HuoXW17(三)反轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase)

功能：

以RNA為模板，以帶3′-OH末端的DNA片段為引物，沿5′至3′方向合成DNA鏈。3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′dNTPMg2+

反轉(zhuǎn)錄酶

3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′

5′TTTTTTT—OH3′

AGACAGGAT……3′

1.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：5′TTTTTTT

2023/7/29IMAU,HuoXW18

2.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H活性；DNA解旋酶活性等。用途：

1.反轉(zhuǎn)錄酶的最主要作用是以mRNA為模板合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)。2.以單鏈DNA或RNA為模板制備探針。功能：

2023/7/29IMAU,HuoXW19(四)核酸酶S1

功能：

水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體中的單鏈部分。核酸酶S1

核酸酶S1

+

核酸酶S1

2023/7/29IMAU,HuoXW20(四)核酸酶S1

用途：

1.除去雙鏈DNA的粘性末端以產(chǎn)生平末端；2.除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；3.分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及DNA-RNA分子的雜交情況等。2023/7/29IMAU,HuoXW21

功能：

催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′-OH末端上。底物是單鏈DNA或有3′突出末端的雙鏈DNA。OH

5′

3′

Mg2+

dNTP

5′

3′(A、G、C、T)n

nppi

5′

3′

OH

Mg2+

dNTP

nppi5′

3′

(A、G、C、T)n

2023/7/29IMAU,HuoXW22

2.底物是平端或3′凹端的雙鏈DNA。5′

3′

Co2+

dNTP

5′

3′(A、G、C、T)n

nppi

5′

3′

Co2+

dNTP

nppi5′

3′

OH

OH

(A、G、C、T)n2023/7/29IMAU,HuoXW23

用途：

1.主要作用是在載體或目的基因3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。2.DNA3′末端的同位素標(biāo)記。2023/7/29IMAU,HuoXW24(六)核糖核酸酶H

水解DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈。RNA

DNA

核糖核酸酶H

DNA

用途：

功能：

用核糖核酸酶H部分水解mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，使未被水解的mRNA作為引物合成cDNA的第二鏈。2023/7/29IMAU,HuoXW25DNA片段的連接重組DNA分子構(gòu)建的最后一步是連接，通過連接酶完成。相對(duì)而言，鈍端的連接效率較低，因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機(jī)會(huì)。而粘性末端的連接效率較高，因?yàn)閮蓚€(gè)粘性末端可以通過氫鍵堿基互補(bǔ)配對(duì)。這種暫時(shí)的、堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)可以提高連接的效率。在分子克隆的連接方式主要有以下幾種：

2023/7/29IMAU,HuoXW26一、連接方式

（一）相同粘性末端的連接

來源:

相同的酶

同尾酶

問題:

極性有兩種可能

同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為“焊死”。DNA片段的連接2023/7/29IMAU,HuoXW27（二）平頭末端的連接

粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端--分子間的連接。

提高連接效率的方法：

加大酶用量（10倍）

加大平頭末端底物的濃度

加入10%PEG（8000），促進(jìn)分子間的有效作用

加入單價(jià)陽離子，150-200mMNaCl

提高反應(yīng)溫度

平頭連接同樣存在兩種極性2023/7/29IMAU,HuoXW28（三）不同粘性末端的連接

突出5'末端

Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平，然后平頭連接

突出3'末端

T4-DNApol切平，然后平頭連接

突出末端不同

Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平

連接后，可能恢復(fù)限制性位點(diǎn)，甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn)。XbaI與HindIII（XbaI恢復(fù)），XbaI與EcoRI（均保留），BamHI與BglII（產(chǎn)生ClaI位點(diǎn)）2023/7/29IMAU,HuoXW29（四）人工粘性末端的連接

5‘突出的末端

外源片段先用Klenow補(bǔ)平；然后用TdT補(bǔ)加polyC；載體片段也用Klenow補(bǔ)平，加polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點(diǎn)遭受破壞。

3’突出的末端

外源片段先用TdT加polyG；載體片段加polyC；然后退火；再用Klenow補(bǔ)齊；連接

平頭末端可直接用TdT補(bǔ)加末端，但以加polyA/T為佳。這樣稍微加熱，AT區(qū)就會(huì)出現(xiàn)單鏈區(qū)域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段2023/7/29IMAU,HuoXW30（五）粘端與平端的連接

linker:人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的、短的雙鏈DNA片段。

–

連接的效率較高

–

酶切時(shí)可能破壞DNA分子的完整。

adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。2023/7/29IMAU,HuoXW31linker的連接方式2023/7/29IMAU,HuoXW32（六）粘性末端的更換

在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口

–BamHI酶切片段用Klenow補(bǔ)平，或用S1酶切平；連接一段linker或Adaptor，使之產(chǎn)生EcoRI粘性末端。這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口。

–

由AluI更換EcoRI：AluI切開，T4-DNApol切平，另一段DNAEcoRI切開，Klenow補(bǔ)平，連接，原來含有AluI的片段變成含有EcoRI2023/7/29IMAU,HuoXW33二、重組率

重組率：連接反應(yīng)結(jié)束后，含有外源DNA片段的重組分子數(shù)與加入的載體分子數(shù)之比。較為理想的重組率為25-75%提高重組率的方法：連接反應(yīng)條件外源片段：載體＝2:1-10:1（分子數(shù)），增加碰撞機(jī)會(huì)，減少自身環(huán)化。載體除磷（磷酸酯酶5’除磷）。TdT在3’端增加人工粘性末端，防止載體自我環(huán)化。2023/7/29IMAU,HuoXW34二、載體(vector)

目的基因進(jìn)入原核或真核細(xì)胞并高效復(fù)制

和表達(dá)蛋白質(zhì)，需要裝入載體才能實(shí)現(xiàn)。

作為基因工程載體所需具備的基本條件：

1.能自我復(fù)制，并具一定的拷貝數(shù)。2.帶有抗性基因，便于篩選和鑒定。4.帶有強(qiáng)啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。3.在適當(dāng)?shù)奈恢糜袉蚊盖形稽c(diǎn)，便于重組操作。2023/7/29IMAU,HuoXW35

1.細(xì)菌質(zhì)粒：最常用的用于目的基因克隆或表達(dá)的載體。2.噬菌體：

主要用于構(gòu)建基因組DNA或

cDNA文庫。3.M13噬菌體：專用于Sanger雙脫氧DNA

測(cè)序

4.

粘粒：用于克隆大片段DNA。

5.

酵母質(zhì)粒：用于在酵母中表達(dá)目的蛋白。6.

病毒：包括人或哺乳動(dòng)物病毒、昆蟲病毒及植物病毒。用于在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。基因工程載體的種類和用途：2023/7/29IMAU,HuoXW36(一)質(zhì)粒(plasmid)

細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌

染色質(zhì)質(zhì)粒

定義:細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。

2023/7/29IMAU,HuoXW37

Ampr

ORI

Tetr

pBR322質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒ORI：復(fù)制起始點(diǎn)，保證高拷貝自我復(fù)制。

結(jié)構(gòu)：

Ampr,

Tetr：

兩個(gè)抗性基因用于篩選陽性克隆。PstI,BamHI：

兩個(gè)單酶切位點(diǎn)用于插入目的基因2023/7/29IMAU,HuoXW38

AmprLacZ

MCS

pfxBlue:克隆質(zhì)粒MCS：MultipleClonningSite

提供多個(gè)單酶切位點(diǎn)用于克隆操作LacZ:藍(lán)白斑篩選陽性克隆2023/7/29IMAU,HuoXW39

P(LacZ)

MCS

Ampr

LacZ

pRS426：原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒P(LacZ)：LacZ啟動(dòng)子用于在原核細(xì)胞驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)。2023/7/29IMAU,HuoXW40

pcDNA3：真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Pcmv：

CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子

驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)BGHpA：加尾信號(hào)

目的基因轉(zhuǎn)錄后加上polyA尾，使其更穩(wěn)定。2023/7/29IMAU,HuoXW41

(二)噬菌體(phage)

1.噬菌體(phage)

2.粘粒(cosmid)

3.M13噬菌體2023/7/29IMAU,HuoXW421.噬菌體(phage)

噬菌體為線狀雙鏈DNA分子，長度約為49Kb，在DNA分子的兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)黏性末端，當(dāng)噬菌體進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，其DNA可迅速通過粘性末端配對(duì)而成雙鏈環(huán)狀的DNA分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)(cohesiveendsite)。2023/7/29IMAU,HuoXW43

選用噬菌體作為構(gòu)建克隆載體材料的依據(jù)（1）噬菌體是一種溫和噬菌體，對(duì)大腸桿菌具有很高的感染能力，容易保存，可進(jìn)行大量增殖。（2）能承載較大的外源DNA片斷。野生型噬菌體頭部容許包裝DNA分子大小75％－105％的DNA片斷，約36.4－51Kb，而且20Kb的區(qū)域?qū)κ删w的生長是不需要的，可以缺失或被外源DNA片斷取代。（3）在DNA分子上有多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，便于多種外源DNA酶切片斷的克隆。2023/7/29IMAU,HuoXW44篩選標(biāo)記：

藍(lán)白斑(LacZ)、噬菌斑等。

用途：

b.用于構(gòu)建基因組或cDNA文庫。

c.用于抗體庫或隨機(jī)肽庫的構(gòu)建。

a.用作一般的克隆載體。2023/7/29IMAU,HuoXW45

特征（1）構(gòu)建的cosmid克隆載體是一種環(huán)形雙鏈DNA分子，其大小不超過36.4kb，一般在10kb以下。（2）具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可以承載外源DNA片斷，轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞，并在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖。2.粘粒(cosmid)2023/7/29IMAU,HuoXW46（3）含有cos位點(diǎn)，提供體外包裝必需的cos末端。（4）構(gòu)建的cosmid克隆載體較小，但能承載比較大的外源DNA片斷，約40kb左右的外源DNA片斷。2023/7/29IMAU,HuoXW47

組成：2.抗性基因；1.質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn)(ORI)；3.用于插入目的基因的單個(gè)酶切位點(diǎn)；4.噬菌體的cos位點(diǎn)。

可見，cosmid是由質(zhì)粒和噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)建而成。

2023/7/29IMAU,HuoXW48

特點(diǎn)：

可插入長達(dá)27～41kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。加入噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成類似于噬菌體的具感染能力的顆粒，方便地進(jìn)入大腸桿菌。粘粒進(jìn)入細(xì)菌后則完全失去噬菌體的功能，而表現(xiàn)質(zhì)粒的特性。2023/7/29IMAU,HuoXW493.M13噬菌體

噬菌體正鏈

復(fù)制

復(fù)制型DNA

經(jīng)pII蛋白造缺口

3′

5′

經(jīng)pII蛋白剪切釋出單鏈DNA(正鏈)

進(jìn)入下一循環(huán)

5′

3′

3′

5′

滾環(huán)復(fù)制

在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制模式圖

2023/7/29IMAU,HuoXW50

M13噬菌體幾個(gè)重要特點(diǎn)：1.M13DNA是單鏈DNA，但在受體細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈環(huán)狀DNA，并能轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，但缺少選擇標(biāo)記和合適的克隆位點(diǎn)。2.M13噬菌體能以單鏈和雙鏈兩種方式存在，均可轉(zhuǎn)染大腸桿菌受體細(xì)胞。3.克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。2023/7/29IMAU,HuoXW51

M13噬菌體用途：1.DNA序列測(cè)定；

2.制備單鏈DNA探針；

3.用于定點(diǎn)突變的研究。

2023/7/29IMAU,HuoXW52第三節(jié)

基因工程的步驟

2023/7/29IMAU,HuoXW53基因工程的基本步驟1.基因工程的上游技術(shù)：基因重組

++連接

轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽性克隆

含重組子的陽性克隆

載體目的基因分、切、接、轉(zhuǎn)、篩2023/7/29IMAU,HuoXW542.

基因工程的下游技術(shù)：

(1)

發(fā)酵工程

(2)

蛋白質(zhì)的分離、純化與質(zhì)量鑒定

發(fā)酵條件(生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)、細(xì)菌培養(yǎng)溫度、空氣通量、pH及培養(yǎng)基成分等)的優(yōu)化組合。

基因工程的基本步驟2023/7/29IMAU,HuoXW55一、目的基因的制備—分

(一)人工合成法(也即化學(xué)合成法)

本方法適用于分子量較小的目的基因(100bp以內(nèi))。缺點(diǎn)：

2.如目的基因DNA序列需通過氨基酸序列推測(cè)，難于保證與天然基因序列一致，往往導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。1.只能合成較小片段的DNA(100bp以內(nèi))。

2023/7/29IMAU,HuoXW56

(二)反轉(zhuǎn)錄法

本法是應(yīng)用得最多的獲取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。

2023/7/29IMAU,HuoXW57

(三)直接從染色體DNA中分離

本方法較適用于制備原核生物目的基因，其原因?yàn)椋?/p>

1.真核細(xì)胞染色體DNA有豐富的內(nèi)含子，在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后不能剪接。

2.真核細(xì)胞的基因多數(shù)為單拷貝，難于分離到足夠的目的基因。

根據(jù)染色體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜，用合適的限制性內(nèi)切酶切割染色體DNA，分離目的基因。2023/7/29IMAU,HuoXW58

(四)從基因文庫(genelibrary)中獲取

基因組文庫：G-文庫

cDNA文庫：c-文庫

(常用)方法：

基因文庫

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中“釣出”有目的基因的克隆。2023/7/29IMAU,HuoXW59(一)粘性末端連接

用同一種或兩種限制性內(nèi)切酶酶切

DNA連接酶

重組質(zhì)粒

質(zhì)粒

目的基因

二、構(gòu)建DNA重組體---接本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)

2023/7/29IMAU,HuoXW60

DNA末端是平口，沒有粘性末端，在這種情況下，用連接力很強(qiáng)的T4噬菌體連接酶將它們連接起來。本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)

。(二)平末端連接

2023/7/29IMAU,HuoXW61(三)用接頭連接

用同一種限制性內(nèi)切酶酶切

DNA連接酶

重組質(zhì)粒

質(zhì)粒

目的基因

+

+

DNA連接酶

接頭(linker)

本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)！

2023/7/29IMAU,HuoXW62(四)尾接法

DNA連接酶

重組質(zhì)粒

質(zhì)粒

目的基因

內(nèi)切酶

末端轉(zhuǎn)移酶

+dGTP

末端轉(zhuǎn)移酶

+dCTP

本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)2023/7/29IMAU,HuoXW63三、將重組體(子)導(dǎo)入宿主細(xì)胞---轉(zhuǎn)

1.重組質(zhì)粒的導(dǎo)入方法

大腸桿菌

CaCl2

0～4℃

感受態(tài)細(xì)胞

重組質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化transformation

含重組質(zhì)粒的大腸桿菌

2023/7/29IMAU,HuoXW64感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):

受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。

2023/7/29IMAU,HuoXW65正常條件下，大部分細(xì)菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的DNA，為了提高轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法：

a.熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

b.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

c.高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化

d.顯微注射法轉(zhuǎn)化

e.接合轉(zhuǎn)化

f.噬菌體轉(zhuǎn)染2023/7/29IMAU,HuoXW66大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率Ca誘導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結(jié)合轉(zhuǎn)化104-52023/7/29IMAU,HuoXW67熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的過程熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌的原理2023/7/29IMAU,HuoXW68四、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞2.重組病毒或重組噬菌體的導(dǎo)入方法

重組病毒重組噬菌體加入病毒的某些蛋白組分

具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒真核細(xì)胞

原核細(xì)胞

轉(zhuǎn)染(transfection)2023/7/29IMAU,HuoXW69噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法2023/7/29IMAU,HuoXW70五、重組體的篩選與鑒定---篩

Ampr

Terr

1.插入失活:例1在Tetr中插入目的基因

在質(zhì)粒固有的功能基因內(nèi)插入目的基因，則該基因不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。2023/7/29IMAU,HuoXW71

篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不是一個(gè)高效的過程，雖然1ng的pUC8可以產(chǎn)生1000-10000個(gè)轉(zhuǎn)化子，意味著只吸收了0.01%的DNA分子。所以必需篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

2023/7/29IMAU,HuoXW72插入失活篩選法:

原理：在質(zhì)粒固有的功能基因（具有抗藥性或營養(yǎng)標(biāo)記）內(nèi)插入目的基因，則該基因不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。例如：在pBR322質(zhì)粒分子上含有四環(huán)素抗性基因（Tetr

）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr

）。在Tetr基因中插入目的基因，會(huì)導(dǎo)致Tetr基因出現(xiàn)功能性失活，從而使含有該種重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長。2023/7/29IMAU,HuoXW732023/7/29IMAU,HuoXW742023/7/29IMAU,HuoXW75利用tetR的插入失活篩選重組克隆2023/7/29IMAU,HuoXW76利用lacZ'基因的插入失活篩選重組子2023/7/29IMAU,HuoXW77

Amp

Tet

123

456

3和5

是陽性克隆

123

456

例1：

2023/7/29IMAU,HuoXW78六、重組體的篩選與鑒定

Apmr

MCS

LacZ

1.插入失活：例1在Laz中插入目的基因2023/7/29IMAU,HuoXW792.β—半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法原理：將外源DNA分子插入到質(zhì)粒載體的lacZ基因上，造成β—半乳糖苷酶的失活效應(yīng)，然后通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在Xgal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化直接觀察出來。2023/7/29IMAU,HuoXW80

X-gal

藍(lán)色化合物

-半乳糖苷酶

Lac-Z基因例2：藍(lán)白斑篩選

2023/7/29IMAU,HuoXW81

3.菌落原位雜交覆蓋濾膜

取下沾有菌落

的濾膜

裂解、變性、固定等與探針

雜交放射性自顯影123

456

3和5是陽性克隆

2023/7/29IMAU,HuoXW82轉(zhuǎn)化子的鑒定通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確的片段，還需要進(jìn)一步的鑒定，鑒定的方法主要有如下幾種情況：

1限制性內(nèi)切酶法：外源片段通過特定的酶切位點(diǎn)插入到載體上，因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質(zhì)粒，電泳分析插入片段長度是否正確。

2PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進(jìn)行鑒定

3菌落原位雜交法：將在后面的章節(jié)中提到。

4基因產(chǎn)物檢測(cè)法：如果使用的是表達(dá)載體，那么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆。2023/7/29IMAU,HuoXW832023/7/29IMAU,HuoXW84同裂酶和同尾酶：同裂酶---來源不同的限制酶識(shí)別的是相同的核苷酸靶序列。1.識(shí)別相同序列產(chǎn)生相同末端2.識(shí)別相同序列產(chǎn)生相同末端3.識(shí)別相同序列，能否切割取決于甲基化如：HindⅢ和HsuIAAGCTTTTCGAA如：SmaICCCGGGXmaICCCGGGGGGCCC