任務(wù)四酵母菌種子的制備技術(shù)

——酵母菌選育技術(shù)工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強(qiáng)

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動物來源抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉(zhuǎn)折點(diǎn)：氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物開發(fā)一個新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗(yàn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌食品工業(yè)中酵母菌及其應(yīng)用一、啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）

啤酒酵母屬于典型的上面酵母，又稱愛丁堡酵母。廣泛應(yīng)用于啤酒、白酒釀造和面包制作。（一）啤酒酵母的形態(tài)特征

細(xì)胞呈圓形或短卵圓形，大小為3～7×5～10μm，通常聚集在一起，不運(yùn)動。單倍體細(xì)胞或雙倍體細(xì)胞都能以多邊出芽方式進(jìn)行無性繁殖，能形成有規(guī)則的假菌絲（芽簇），但無真菌絲。有性繁殖為2個單倍體細(xì)胞同宗或異宗接合或雙倍體細(xì)胞直接進(jìn)行減數(shù)分裂形成1～4個子囊孢子。細(xì)胞形態(tài)往往受培養(yǎng)條件的影響，但恢復(fù)原有的培養(yǎng)條件，細(xì)胞形態(tài)即可恢復(fù)原狀。（二）啤酒酵母的培養(yǎng)特征

麥芽汁固體培養(yǎng)，菌落呈乳白色，不透明，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣略呈鋸齒狀；隨培養(yǎng)時間延長，菌落顏色變暗，失去光澤。麥芽汁液體培養(yǎng)，表面產(chǎn)生泡沫，液體變混，培養(yǎng)后期菌體懸浮在液面上形成酵母泡蓋。因此而稱上面酵母。

（三）啤酒酵母的生理生化特性

化能異養(yǎng)型，能發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖以及1/3的棉子糖，不發(fā)酵蜜二糖、乳糖和甘油醛，也不發(fā)酵淀粉、纖維素等多糖。不分解蛋白質(zhì)，可同化氨基酸和氨態(tài)氮，不同化硝酸鹽。需要B族維生素和P、S、Ca、Mg、K、Fe等無機(jī)元素。兼性厭氧，有氧條件下，將可發(fā)酵性糖類通過有氧呼吸作用徹底氧化為CO2和H2O，釋放大量能量供細(xì)胞生長；無氧條件下，使可發(fā)性糖類通過發(fā)酵作用（EMP途徑）生成酒精和CO2，釋放較少能量供細(xì)胞生長。最適生長溫度25℃，發(fā)酵最適溫度10-25℃。最適發(fā)酵pH為4.5-6.5。真正發(fā)酵度達(dá)60%-65%。二、葡萄酒酵母

（Saccharomycesellipsoideus）

葡萄酒酵母屬于啤酒酵母的橢圓變種，簡稱橢圓酵母。常用于葡萄酒和果酒的釀造。（一）葡萄酒酵母的形態(tài)特征

細(xì)胞呈橢圓形或長橢圓形，大小為3～10×5～15μm，不運(yùn)動。單倍體細(xì)胞或雙倍體細(xì)胞都能以多邊出芽方式進(jìn)行無性繁殖，形成有規(guī)則的假菌絲。在環(huán)境不利條件下進(jìn)行有性繁殖：2個單倍體細(xì)胞同宗或異宗接合或雙倍體細(xì)胞直接進(jìn)行減數(shù)分裂形成1～4個子囊孢子。細(xì)胞形態(tài)往往受培養(yǎng)條件的影響，但恢復(fù)原有的培養(yǎng)條件，細(xì)胞形態(tài)即可恢復(fù)原狀。

（二）葡萄酒酵母的培養(yǎng)特征

葡萄汁固體培養(yǎng)，菌落呈乳黃色，不透明，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣整齊；隨培養(yǎng)時間延長，菌落顏色變暗。液體培養(yǎng)變濁，表面形成泡沫，聚凝性較強(qiáng)，培養(yǎng)后期菌體沉降于容器底部。

（三）葡萄酒酵母的生理生化特點(diǎn)

化能異養(yǎng)型，可發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖以及1/3的棉子糖，不發(fā)酵蜜二糖、乳糖和甘油醛，也不發(fā)酵淀粉、纖維素等多糖。不分解蛋白質(zhì)，不還原硝酸鹽，可同化氨基酸和氨態(tài)氮。需要B族維生素和P、S、Ca、Mg、K、Fe等無機(jī)元素。兼性厭氧，有氧條件下，將可發(fā)性糖類通過有氧呼吸作用徹底氧化為CO2和H2O，釋放大量能量供菌體繁殖；無氧條件下，使可發(fā)酵性糖類通過發(fā)酵作用（EMP途徑）生成酒精和CO2，釋放較少能量供細(xì)胞繁殖。最適生長溫度25℃，葡萄酒發(fā)酵最適溫度15-25℃。最適發(fā)酵pH為3.3-3.5。耐酸、耐乙醇、耐高滲、耐二氧化硫能力強(qiáng)于啤酒酵母。葡萄酒發(fā)酵后乙醇含量達(dá)16%以上。三、卡爾酵母（SaccharomgcesCarlsbergensis）卡爾酵母屬于典型的下面酵母，又稱卡爾斯伯酵母或嘉士伯酵母。常用于啤酒釀造、藥物提取以及維生素測定的菌種。

（一）卡爾酵母的形態(tài)特征

細(xì)胞呈橢圓形，大小為3～5×7～10μm，通常分散獨(dú)立存在，不運(yùn)動。單倍體細(xì)胞或雙倍體細(xì)胞大多都以單端出芽方式進(jìn)行無性繁殖，能形成不規(guī)則的假菌絲，但無真菌絲。采用特殊方法培養(yǎng)才能進(jìn)行有性生殖形成子囊孢子。

（二）卡爾酵母的培養(yǎng)特征

麥芽汁固體培養(yǎng)，菌落呈乳白色，不透明，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣整齊；隨培養(yǎng)時間延長，菌落顏色變暗，失去光澤。麥芽汁液體培養(yǎng)，表面產(chǎn)生泡沫，液體變混，培養(yǎng)后期菌體沉降于容器底部，因此又稱下面酵母。

（三）卡爾酵母的生理生化特點(diǎn)

化能異養(yǎng)型，能發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、蜜二糖、麥芽三糖和甘油醛以及全部的棉子糖，不發(fā)酵乳糖以及淀粉、纖維素等多糖。不分解蛋白質(zhì)，不還原硝酸鹽，可同化氨基酸和氨態(tài)氮。需要B族維生素以及P、S、Ca、Mg、K、Fe等無機(jī)離子。兼性厭氧，有氧條件下，將可發(fā)性糖類通過有氧呼吸作用徹底氧化為CO2和H2O，釋放大量能量供菌體繁殖；無氧條件下，使可發(fā)酵性糖類通過發(fā)酵作用（EMP途徑）生成酒精和CO2，釋放較少能量供細(xì)胞繁殖。最適生長溫度25℃，啤酒發(fā)酵最適溫度5-10℃。最適發(fā)酵pH為4.5-6.5，真正發(fā)酵度為55%-60%。四、產(chǎn)蛋白假絲酵母（Candidautilis）產(chǎn)蛋白假絲酵母，又稱產(chǎn)朊假絲酵母或食用圓酵母，富含蛋白質(zhì)和維生素B，常作為生產(chǎn)食用或飼用單細(xì)胞蛋白（SCP）以及維生素B的菌株。

（一）產(chǎn)蛋白假絲酵母的形態(tài)特征

細(xì)胞呈圓形、橢圓形或臘腸形，大小為3.5～4.5×7.0～13.0μm，以多邊出芽方式進(jìn)行無性繁殖，形成假菌絲。沒有發(fā)現(xiàn)有性生殖和有性孢子，屬于半知菌類酵母菌。

（二）產(chǎn)蛋白假絲酵母的培養(yǎng)特征

麥芽汁固體培養(yǎng)，菌落呈乳白色，表面光滑濕潤，有光澤或無光澤，邊緣整齊或菌絲狀；玉米固體培養(yǎng)產(chǎn)生原始狀假菌絲。葡萄糖酵母汁蛋白胨液體培養(yǎng)，表面無菌膜，液體混濁，管底有菌體沉淀。

（三）產(chǎn)蛋白假絲酵母的生理生化特點(diǎn)

化能異養(yǎng)型，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和1/3的棉子糖，不發(fā)酵半乳糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖。能同化尿素、銨鹽和硝酸鹽，不分解蛋白質(zhì)和脂肪。兼性厭氧，有氧條件下，進(jìn)行有氧呼吸；無氧條件下，進(jìn)行酒精發(fā)酵。最適生長溫度25℃，最適生長pH為4.5～6.5。在發(fā)酵工業(yè)中，常采用富含半纖維的紙漿廢液、稻草、稻殼、玉米芯、木屑、啤酒廢渣等水解液和糖蜜為主要原料，培養(yǎng)產(chǎn)蛋白假絲酵母，生產(chǎn)食用或飼用單細(xì)胞蛋白和維生素B。

酵母菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用（一）啤酒釀造（二）果酒釀造（三）白酒釀造（四）面包加工（五）單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)

（一）啤酒釀造

啤酒釀造是以大麥、水為主要原料，以大米或其它未發(fā)芽的谷物、酒花為輔助原料；大麥經(jīng)過發(fā)芽產(chǎn)生多種水解酶類制成麥芽；借助麥芽本身多種水解酶類將淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分解為可溶性糖類、糊精以及氨基酸、肽、胨等低分子物質(zhì)制成麥芽汁；麥芽汁通過酵母菌的發(fā)酵作用生成酒精和CO2以及多種營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)；最后經(jīng)過過濾、包裝、殺菌等工藝制成CO2含量豐富、酒精含量僅3%～4%、富含多種營養(yǎng)成份、酒花芳香、苦味爽口的飲料酒即成品啤酒。啤酒的種類，根據(jù)酵母品種可分為上面發(fā)酵啤酒和下面發(fā)酵啤酒；根據(jù)顏色可分為淡色啤酒和濃色啤酒；根據(jù)生產(chǎn)方式可分為鮮啤酒、純鮮啤酒和熟啤酒.1．啤酒發(fā)酵優(yōu)良酵母的評估及選育（1）啤酒酵母優(yōu)良性狀的評估。啤酒酵母應(yīng)具有以下優(yōu)良性狀：①生長繁殖力強(qiáng)，發(fā)酵活力高；②代謝產(chǎn)物能夠賦予啤酒良好的風(fēng)味；③聚凝性強(qiáng),沉降速度快,發(fā)酵結(jié)束易與發(fā)酵液分離,便于菌體回收。（2）優(yōu)良菌種的選育。①菌種篩選。②誘變育種。③雜交育種。例如，通過雜交育種有可能獲得凝聚性強(qiáng)的新菌種、風(fēng)味良好的新菌種和發(fā)酵度比較高的新菌種。④細(xì)胞融合育種。例如，凝聚性強(qiáng)但發(fā)酵度低的菌株和發(fā)酵度高但凝聚性弱的菌株通過細(xì)胞融合有可能產(chǎn)生凝聚性強(qiáng)和發(fā)酵度高的新型細(xì)胞。2．啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)

（1）工藝流程。

斜面原種→活化（25℃1～2d）→2個100mL富士瓶(25℃1～2d)→2個1000mL巴士瓶(25℃1～2d)→2個10L卡氏罐(25℃1～2d)→200L漢森式種母罐(15℃1～2d)→2t擴(kuò)大罐(10℃1～2d)→10t繁殖槽→(8℃1～2d)→主發(fā)酵。

（2）技術(shù)要點(diǎn)。

①溫度控制。培養(yǎng)初期，采用酵母菌最適生長溫度25℃培養(yǎng)，之后每擴(kuò)大培養(yǎng)1次，溫度均有所降低，使酵母菌逐步適應(yīng)低溫發(fā)酵的要求。

②接種時間。每次擴(kuò)大培養(yǎng)均采用對數(shù)生長期后期的種子液接種，一般泡沫達(dá)到最高將要回落時為對數(shù)生長期。

③注意及時通風(fēng)供氧。從斜面原種至卡氏罐為實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)階段，應(yīng)注意每天定時搖動容器，達(dá)到供氧目的；從漢森罐至酵母繁殖槽為生產(chǎn)現(xiàn)場擴(kuò)大培養(yǎng)階段，應(yīng)定時通入無菌壓縮空氣供氧。

3．啤酒釀造工藝

（1）工藝流程。原料大麥→清選→分級→浸漬→發(fā)芽→干燥→麥芽及輔料粉碎→糖化→過濾→麥汁煮沸→麥汁沉淀→麥汁冷卻→接種→酵母繁殖→主發(fā)酵→后發(fā)酵→過濾→包裝→殺菌→貼標(biāo)→成品。

（2）技術(shù)要點(diǎn)。

①接種與酵母增殖。冷卻麥芽汁入酵母繁殖槽，接種6代以內(nèi)回收的酵母泥5‰（或擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液），控制品溫6～8℃，好氧培養(yǎng)12～24h，待起發(fā)后入發(fā)酵池（罐）進(jìn)行主發(fā)酵。

②主發(fā)酵。主發(fā)酵也稱前發(fā)酵，可分為四個時期：起泡期：入發(fā)酵池（罐）后4～5h，酵母菌產(chǎn)生的CO2使麥芽汁飽和，在麥芽汁表面出現(xiàn)白色、乳脂狀氣泡，稱為起泡期。此時不需人工降溫，保持2～3d。高泡期：隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌厭氧代謝旺盛，使泡沫層加厚，溫度升高，發(fā)酵進(jìn)入高泡期。此時需開動冰水人工降溫，最高發(fā)酵溫度不超過9℃，保持2～3d。落泡期：發(fā)酵5～6d后，泡沫開始回縮，顏色變深，稱為落泡期。此時需開動冰水逐漸降溫，維持2d。泡蓋形成期：發(fā)酵7～8d后，泡沫消退，形成泡蓋（由酒花樹脂、蛋白質(zhì)多酚復(fù)合物、泡沫和死酵母構(gòu)成），稱為泡蓋形成期。此時應(yīng)急劇降溫至4～5℃，使酵母沉降，并打撈泡蓋、回收酵母，結(jié)束主發(fā)酵。

③后發(fā)酵。后發(fā)酵的主要作用是使殘?zhí)抢^續(xù)發(fā)酵，促進(jìn)CO2在酒液中飽和；同時利用酵母內(nèi)酶還原雙乙酰；④后處理。后發(fā)酵結(jié)束，酒液經(jīng)過過濾、裝瓶、熱殺菌（60℃30min）處理，稱為熟啤酒，而不經(jīng)過熱殺菌的啤酒稱為鮮啤酒。（二）果酒釀造

果酒釀造是以多種水果如葡萄、蘋果、梨、桔子、山楂、楊梅、獼猴桃等為原料，經(jīng)過破碎、壓榨，制取果汁；果汁通過酵母菌的發(fā)酵作用形成原酒；原酒再經(jīng)陳釀、過濾、調(diào)配、包裝等工藝制成酒精含量8.5%以上、含多種營養(yǎng)成分的飲料酒稱為果酒。在各種果酒中葡萄酒是主要品種，其產(chǎn)量居世界第二位飲料酒種。

1．果酒的主要種類果酒一般以所用的原料來命名，如葡萄酒、蘋果酒、梨酒等，根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)不同，果酒有如下種類。

（1）根據(jù)釀制方法。

①發(fā)酵酒：用果汁或果漿經(jīng)酒精發(fā)酵釀制而成。

②蒸餾酒：發(fā)酵果酒經(jīng)蒸餾后制成，如白蘭地、水果白酒。

③露酒：用果實(shí)、果汁或果皮經(jīng)酒精浸泡、兌制而成。

④汽酒：含CO2的果酒。

（2）根據(jù)果酒含糖量。

①干酒。每100mL酒中含糖量少于0.4g。

②半干酒。每100mL酒中含糖量為0.4～1.2g。

③半甜酒。每100mL酒中含糖量為1.2～5.0g。

④甜酒。每100mL酒中含糖量為5g以上。

（3）根據(jù)果酒酒精含量。

①低度果酒。酒精含量在17%（V/V）以下果酒。

②高度果酒。酒精含量在18%（V/V）以上的果酒。2．果酒釀造工藝

（1）工藝流程。水果→分選→洗滌→破碎→壓榨→果汁→成分調(diào)整→添加SO2、接種酒母→主發(fā)酵→后發(fā)酵→陳釀→冷、熱處理→過濾→調(diào)配→灌酒→殺菌→貼標(biāo)→成品。

（2）技術(shù)要點(diǎn)。

前發(fā)酵。前發(fā)酵的目的是進(jìn)行酒精發(fā)酵，產(chǎn)生芳香物質(zhì)，浸提色素物質(zhì)。其方法有分離發(fā)酵法和混和發(fā)酵法兩種。分離發(fā)酵法是水果經(jīng)破碎、壓榨后，僅有果汁入發(fā)酵池進(jìn)行發(fā)酵；而混和發(fā)酵法是水果破碎后不經(jīng)壓榨，將果汁、果漿、皮渣一起入發(fā)酵池進(jìn)行發(fā)酵。

分離發(fā)酵法：果汁入池后，加入亞硫酸鈉，使SO2含量達(dá)到80～100mg/L。然后接種5%～10%的酒母液，控制品溫25～30℃進(jìn)行發(fā)酵。待發(fā)酵旺盛時，將品溫控制在20～25℃進(jìn)行低溫發(fā)酵。當(dāng)殘?zhí)窍陆抵?g/L時，分離酒腳進(jìn)入后發(fā)酵。

混和發(fā)酵法：果漿、果汁、皮渣入池后，加入亞硫酸鈉，使SO2含量達(dá)到80～100mg/L。然后接種5%～10%酒母液，用木板或竹簾將皮渣壓入液面下20～30cm后進(jìn)行發(fā)酵。前期品溫控制25～30℃，待發(fā)酵旺盛時，將品溫調(diào)至20～25℃進(jìn)行低溫發(fā)酵。當(dāng)殘?zhí)窍陆抵?g/L時，進(jìn)行壓榨，取壓榨后的發(fā)酵液進(jìn)入后發(fā)酵。（三）白酒釀造

酒曲的主要種類（1）大曲:大曲是固態(tài)發(fā)酵法釀造大曲白酒的糖化發(fā)酵劑。它以小麥或大麥、豌豆為曲料，經(jīng)過粉碎、加水拌料、踩曲制坯、堆積培養(yǎng)，依靠自然界帶入的各種釀酒微生物（包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌）在其中生長繁殖制成成曲，再經(jīng)貯存后制成陳曲。大曲有高溫曲（制曲溫度60℃以上）和中溫曲（制曲溫度不超過50℃）兩種類型。目前國內(nèi)絕大多數(shù)著名的大曲白酒均采用高溫曲生產(chǎn)，如茅臺、瀘州、西風(fēng)、五糧液等。（2）麩曲:麩曲是固態(tài)發(fā)酵法釀造麩曲白酒的糖化劑。它以麩皮為主要曲料，以新鮮酒糟為配料，經(jīng)過潤水、蒸煮、冷卻后，接種黑曲霉和黃曲霉混和（混和比例為7：3），再經(jīng)通風(fēng)培養(yǎng)制成成曲。

（3）小曲（米曲）:小曲（米曲）是半固態(tài)發(fā)酵法釀造小曲白酒（米酒）的糖化發(fā)酵劑。它以米粉或米糠為原料，添加或不添加中草藥，經(jīng)過浸泡、粉碎，接入純種根霉和酵母菌或二者混和種曲，再經(jīng)制坯、入室培養(yǎng)、干燥等工藝制成小曲。（4）液體曲。液體曲可作為液態(tài)發(fā)酵法釀酒制醋的糖化劑。它是將曲霉菌的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中進(jìn)行深層液體通氣培養(yǎng)，得到含有豐富酶系的培養(yǎng)液稱為液體曲。

（四）面包加工面包是一種營養(yǎng)豐富、組織膨松、易于消化的方便食品。它以面粉、糖、水為主要原料，利用面粉中淀粉酶水解淀粉生成的糖類物質(zhì)，經(jīng)過酵母菌的發(fā)酵作用產(chǎn)生醇、醛、酸類物質(zhì)和CO2；在高溫焙烤過程中，CO2受熱膨脹使面包成為多孔的海綿結(jié)構(gòu)和松軟的質(zhì)地。

面包的種類很多，主要分為主食面包和點(diǎn)心面包。點(diǎn)心面包又根據(jù)配料不同，分為果子面包、雞蛋面包、牛奶面包、蛋黃面包和維生素面包等。

1．菌種及發(fā)酵劑類型:

面包發(fā)酵劑菌種是啤酒酵母,應(yīng)選擇發(fā)酵力強(qiáng)、風(fēng)味良好、耐熱、耐酒精的酵母菌株。面包發(fā)酵劑類型有壓榨酵母（Compressedyeast）和活性干酵母（activedryyeast）二種。壓榨酵母又稱鮮酵母，是酵母菌經(jīng)液體深層通氣培養(yǎng)后再經(jīng)壓榨而制成。發(fā)酵活力高，使用方便，但不耐貯藏?；钚愿山湍甘菈赫ソ湍附?jīng)低溫干燥或噴霧干燥或真空干燥而制成。便于貯藏和運(yùn)輸，但活性有所減弱，需經(jīng)活化后使用。2．活性干酵母面包發(fā)酵劑的制備

（1）工藝流程。糖蜜→澄清處理→添加氮源、磷源→滅菌→發(fā)酵培養(yǎng)基→接入種子液→液體深層通氣培養(yǎng)→冷卻→酵母分離→洗滌→壓榨成形→干燥→成品。

（2）技術(shù)要點(diǎn)。

酵母分離、壓榨和干燥：培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)冷卻降溫，送入酵母分離機(jī)進(jìn)行離心分離。得到的濕菌體用冷水洗滌后壓榨成形，使壓榨酵母的含水量達(dá)65%～70%。最后，采用30℃低溫將壓榨酵母烘干至含水量6%～8%制成活性干酵母。

（五）單細(xì)胞蛋白（SCP）的開發(fā)1．應(yīng)用微生物生產(chǎn)SCP的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%左右，并含有多種氨基酸、維生素、礦物元素和粗脂肪等營養(yǎng)成分，易被人畜消化吸收；微生物繁殖快，短時間可獲得大量產(chǎn)品；微生物對營養(yǎng)要求適應(yīng)性強(qiáng)，可利用多種廉價原料進(jìn)行生產(chǎn)；微生物的生長條件完全受人工控制，可在工廠中大量生產(chǎn)。

2．開發(fā)單細(xì)胞蛋白常用菌種及其使用的主要原料開發(fā)SCP的微生物主要是酵母菌，其次藻類。用于生產(chǎn)SCP的原料有以下幾類：①工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的廢棄物和下腳料，如紙漿廢液、啤酒廢渣、味精廢液、淀粉廢液、豆制品廢液；②碳水化合物類，如淀粉質(zhì)和纖維質(zhì)的水解糖液；③碳?xì)浠衔镱悾缂淄?、乙烷、丙烷及短鏈烷烴；④石油產(chǎn)品類。

生產(chǎn)SCP常用菌種及其主要原料

菌種 學(xué)名 主要原料

產(chǎn)朊假絲酵母 Candidautilis 紙漿廢液、木屑等

產(chǎn)朊假絲酵母大細(xì)胞變種

糖蜜Candidautilisvar.major

日本假絲酵母 Mycotorulajaponica 紙漿廢液

熱帶假絲酵母 Candidatropicalis 短鏈烷烴

甲烷假單孢菌 Pseudomonasmethanica 甲烷

畢赤氏酵母 Pichia 甲醇或乙醇

漢遜氏酵母 Hansenula 甲醇或乙醇

粉粒小球藻 Chlorellapyrenoidosa CO2和光能

普通小球藻 Chlorellavulgaris CO2和光能新種分離與篩選的步驟定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。一、酵母菌種子的選育技術(shù)——自然選育（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二）增殖培養(yǎng)為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。富集的主要方案：定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。菌落的選出從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素

從形態(tài)的角度菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。（三）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。（四）篩選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗(yàn)自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。酵母菌種子的誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？回復(fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變

——誘變育種物理、化學(xué)或生物誘變方法誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。具有速度快、收效大、方法簡便等特點(diǎn)。一、誘變劑和誘變處理物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性?；瘜W(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。

使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備簡單。而用電離輻射進(jìn)行工作時，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。

5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對數(shù)期的細(xì)胞；有的作用于休止期，就可選用孢子。

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。(三)誘變處理根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。

(四)中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理性延遲)或基因處于不純的狀態(tài)（分離性延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。

方法：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。篩選的方法隨機(jī)篩選形態(tài)理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。(五)分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個／ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個／ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。操作步驟

1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。

2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)108個／ml左右，作為待處理菌懸液。

3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。

4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。

5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。

6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。

7．挑取菌落進(jìn)行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。操作步驟糖（糖化酶及蛋白酶產(chǎn)生菌的誘變）

1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個／ml，此為待處理孢子懸液。

2．MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。

3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1ml孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-3兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計(jì)數(shù)。

4．死亡率計(jì)算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。

5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．——酵母菌雜交育種雜交育種一般指兩個不同基因型的菌株通過接合或者原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株的過程。常規(guī)雜交育種常規(guī)的雜交育不需要脫壁酶處理，就能使細(xì)胞結(jié)合發(fā)生遺傳物質(zhì)重新組合。酵母雜交——酵母原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。（一）原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)1、雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。2、受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。3、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程。4、存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。5、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。6、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。7、有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。（二）原生質(zhì)體融合育種步驟1．標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2．原生質(zhì)體制備。3．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6．生產(chǎn)性能篩選。（三）原生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn)1、標(biāo)記菌種的選擇獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實(shí)驗(yàn)室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。

2、原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。

（四）影響原生質(zhì)體制備的因素1．菌體的前處理為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素、EDTA、甘氨酸等。2．菌體的培養(yǎng)時間

為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3．酶濃度對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。4．酶處理溫度

5．酶處理時間6．滲透壓穩(wěn)定劑

滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)在育種中的應(yīng)用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)是指采用熱、紫外線、電離輻射以及某些生化試劑、抗生素等作為滅活處理單一親株或雙親株的原生質(zhì)體，使之失去再生能力，經(jīng)細(xì)胞融合后，由于損傷部位互補(bǔ)可以形成能再生的融合體的過程。——酵母菌基因重組育種基因重組育種：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個細(xì)胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。酵母分離純化（1）平板劃線分離