大豆制品中尿素酶（脲酶）

活性的測(cè)定晁洪雨2016.4.8

大豆制品中尿素酶（脲酶）

活性的測(cè)定

一、測(cè)定的原因：生大豆含有多種能被熱破壞的抗?fàn)I養(yǎng)因子（如抗胰蛋白酶）。大豆中脲酶的含量與抗胰蛋白酶成正相關(guān)，且能很快、很經(jīng)濟(jì)地予以測(cè)定。所以，測(cè)定脲酶的活性（UA），就可以預(yù)測(cè)大豆餅粕的加工程度是否適當(dāng)及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)劣。一、測(cè)定的原因：二、影響大豆制品脲酶活性的因素：①大豆加熱過(guò)程中的溫度；②大豆原料最初的水分含量；③大豆粒度的大小；④加熱時(shí)所用壓力的大??；⑤大豆加熱時(shí)間的長(zhǎng)短。二、影響大豆制品脲酶活性的因素：

高溫、高濕、高壓，粒度小，時(shí)間長(zhǎng)脲酶活性低。但是，加工過(guò)度，一些氨基酸會(huì)被破壞。所以脲酶活性過(guò)高（豆制品過(guò)生）或過(guò)低（豆制品過(guò)熟）都表明豆制品質(zhì)量較差。高溫、高濕、高壓，粒度小，時(shí)間長(zhǎng)脲酶活性低。但是三、測(cè)定原理：脲酶活性測(cè)定實(shí)際上是在一定條件下(pH=7.0，T=30℃)，測(cè)定每克試樣、每分鐘分解尿素所產(chǎn)生的氨的量。脲酶NH2CONH2→→2NH3↑+CO2

三、測(cè)定原理：

四、測(cè)定方法：（一）定性法：1、酚紅法（1）原理：酚紅指示劑在pH

6.4-8.2時(shí)由黃變紅，大豆制品中所含的脲酶pH=7.0，T=30℃時(shí)可將尿素水解產(chǎn)生氨，釋放的氨可使酚紅指示劑變紅，根據(jù)變紅的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)判斷脲酶活性的大小。

（2）儀器和試劑：粉碎機(jī)：粉碎時(shí)不產(chǎn)生強(qiáng)烈發(fā)熱分析天平：感量0.01g25ml納式比色管恒溫水浴鍋0.1%酚紅指示劑：0.1g苯酚紅溶于100ml

95%乙醇溶液結(jié)晶尿素：分析純大豆制品脲酶活性測(cè)定ppt課件（3）方法：粉碎→稱取0.05±0.001g→放入試管→加入尿素0.2g、指示劑5滴→加蒸餾水25mL→搖動(dòng)10s→立即置于30±0.5℃水浴鍋→計(jì)時(shí)觀察溶液變紅時(shí)間→5min后取出試管，搖勻繼續(xù)觀察大豆制品脲酶活性測(cè)定ppt課件

空白試驗(yàn)：不加尿素，其他同上。品質(zhì)判定：如果溶液為明顯的粉紅色，則認(rèn)為該大豆制品脲酶活性超標(biāo)，為不合格產(chǎn)品。?0-1min變紅，活性非常強(qiáng)（＞1.0）；?1-2min變紅，活性大概0.5-1.0；

?

2-5min變紅，活性大概0.3-0.5?？瞻自囼?yàn)：不加尿素，其他同上。（4）注意事項(xiàng)：1.粉碎樣品時(shí)，不應(yīng)產(chǎn)生大量熱，否則會(huì)影響結(jié)果判定；2.稱量樣品時(shí)，一定要將樣品混合均勻，否則會(huì)造成試驗(yàn)誤差；

3.試樣和空白試驗(yàn)同時(shí)操作，過(guò)程要迅速，防止時(shí)間影響。

（4）注意事項(xiàng)：2、尿素酚紅法（1）原理：酚紅指示劑在pH

6.4-8.2時(shí)由黃變紅，大豆制品中所含的尿素酶可將尿素水解產(chǎn)生氨，釋放的氨可使酚紅指示劑變紅，根據(jù)變紅樣品占所有樣品的比例來(lái)判斷脲酶活性的大小。

大豆制品脲酶活性測(cè)定ppt課件（2）儀器和試劑：表面皿；0.2N氫氧化鈉溶液：稱取0.8g氫氧化鈉溶于100ml蒸餾水；1.0N硫酸溶液：移取14.0ml濃硫酸溶于500ml蒸餾水；大豆制品脲酶活性測(cè)定ppt課件尿素-酚紅試劑：用500ml燒杯將0.8g酚紅溶于20ml

0.2N氫氧化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至約300ml，加入60g尿素，并溶解之，轉(zhuǎn)移至2L容量瓶，沖洗燒杯數(shù)次,加蒸餾水至約1.5L，加入9.4ml

1.0N硫酸溶液，用蒸餾水定容至2L；

尿素-酚紅試劑：用500ml燒杯將0.8g酚紅溶于20ml

此時(shí)溶液應(yīng)具有明亮的琥珀色；（過(guò)段時(shí)間溶液會(huì)變?yōu)樯铋偌t色，可滴入稀硫酸溶液攪拌之，直至溶液再次變?yōu)殓晟┐藭r(shí)溶液應(yīng)具有明亮的琥珀色；（過(guò)段時(shí)間溶液會(huì)變

（3）方法：將一滿匙樣品放入表面皿中，攤平，將以調(diào)好的尿素-酚紅試劑滴入表面皿中的樣品上，直至完全浸濕，停留5min，觀察樣品的顏色反應(yīng)。如果紅斑面積多于20%，則認(rèn)為該樣品脲酶活性超標(biāo)，為不合格產(chǎn)品。

（4）注意事項(xiàng)：1.對(duì)于樣品較粗、具有大塊狀的樣品，最好將其稍微粉碎，亦不可太細(xì)，否則不容易觀察；2.樣品一定要鋪平，容易觀察；3.溶液保質(zhì)期為3個(gè)月，最好1個(gè)月內(nèi)用完；4.此方法容易受顆粒度影響。大豆制品脲酶活性測(cè)定ppt課件

（二）定量法1、pH增值法（1）原理：脲酶水解尿素產(chǎn)生氨，使溶液的pH值升高，通過(guò)測(cè)定樣品溶液的pH值和空白的pH值之差來(lái)計(jì)算脲酶的活性。脲酶活性定義為：在30℃和pH=7的條件下，每分鐘每克大豆制品分解尿素后所釋放的氨態(tài)氮的毫升數(shù)。（二）定量法（2）儀器與器皿酸度計(jì)（pH計(jì)）：具有玻璃電極、甘汞電極恒溫水?。喉毮鼙３譁囟?0±0.5℃試管：20×150mm并配有橡皮塞（50mL）（2）儀器與器皿（3）試劑磷酸緩沖液0.05mol/L：稱取3.403gKH2PO4溶于100mL蒸餾水中。再稱取4.355gK2HPO4溶于100mL蒸餾水中，合并兩者并配成1000mL，用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿調(diào)節(jié)pH=7.0。尿素緩沖液：稱取15g尿素，溶于500mL磷酸緩沖液中，調(diào)節(jié)pH=7.0。（3）試劑

樣品粉碎：至少60%通過(guò)400微米試驗(yàn)篩。（4）操作步驟準(zhǔn)確稱取0.400±0.00lg樣品2份，分別置于2支試管中。一支試管加入20mL磷酸緩沖液，作為空白試驗(yàn)（A管），另一支加入20mL尿素緩沖液（B管）。樣品粉碎：至少60%通過(guò)400微米試驗(yàn)篩。

蓋塞混勻，在30℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保持30min。在此期間，每隔5min搖勻一次。取出立即在流水中冷卻，5min內(nèi)測(cè)定溶液pH值。

（5）計(jì)算UA=pH(B管)-pH(A管)（5）計(jì)算

2、滴定法（1）原理：將粉碎的大豆制品與中性尿素緩沖溶液混合，在30℃保持30min后，尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生氨，用過(guò)量的鹽酸溶液中和氨，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴。

2、滴定法

（2）脲酶活性定義在30℃和pH＝7的條件下，每分鐘每克大豆制品分解尿素后，所釋放的氨態(tài)氮的毫克數(shù)。（2）脲酶活性定義

(3)儀器與設(shè)備樣品篩：孔徑200μm酸度計(jì)：精度0.02pH，附有磁力攪拌器和滴定裝置恒溫水?。嚎煽販?0±0.5℃試管：直徑18mm，長(zhǎng)150mm，有磨口塞子(3)儀器與設(shè)備精密計(jì)時(shí)器粉碎機(jī)：粉碎時(shí)應(yīng)不生強(qiáng)熱（如球磨機(jī)）分析天平：感量0.1mg移液管：10m1精密計(jì)時(shí)器

（4）試劑尿素：分折純。磷酸氫二鈉：分析純。磷酸二氫鉀：分析純。尿素緩沖液（pH6.9至7.0）：4.45g磷酸氫二鈉和3.40g磷酸二氫鉀溶于水并稀釋至1000mL，再將30g尿素溶于此緩沖溶液中，（4）試劑鹽酸：分析純，0.1mol/L溶液氫氧化鈉：分析純，0.1mol/L標(biāo)推溶液，按GB601-77《標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法》的規(guī)定配制。鹽酸：分析純，0.1mol/L溶液

（5）操作方法稱取0.2g試樣→轉(zhuǎn)入試管→加入10mL尿素緩沖液→立即蓋塞、劇烈搖動(dòng)→馬上置于30±0.5℃恒溫水浴→準(zhǔn)確計(jì)時(shí)30min→加入10mL0.1mol/L鹽酸→迅速冷卻到20℃→內(nèi)容物全都轉(zhuǎn)入燒杯→立即用氫氧化鈉標(biāo)淮溶液滴定到pH4.70。（5）操作方法空白試管→加入10mL尿素緩沖液→加入10mL0.1mol/L鹽酸→稱取0.2g試樣加入試管→立即蓋塞、劇烈搖動(dòng)→馬上置于30±0.5℃恒溫水浴→準(zhǔn)確計(jì)時(shí)30min→迅速冷卻到20℃→內(nèi)容物全都轉(zhuǎn)入燒杯→立即用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到pH4.70?？瞻自嚬堋尤?0mL尿素緩沖液→加入1

（6）計(jì)算結(jié)果UA=14×C(V0-V)/(30×m)C—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L）V0—空白試驗(yàn)消耗氫氧化鈉溶液體積（m