稻蝦共作模式稻田反硝化微生物群落結構的影響因素

反硝化作用是在低氧或厭氧條件下，通過反硝化細菌中的亞硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體，并將其轉化為氨氮信息。大量研究表明,nirK型反硝化細菌存在于農田、森林、草地、沉積物及水體等環(huán)境中本文利用IlluminaMiseq高通量測序技術對稻蝦共作模式稻田土壤中nirK反硝化細菌的群落結構及多樣性進行分析,并通過冗余分析(RDA)來探索影響nirK反硝化細菌的關鍵因子,以期揭示稻蝦共作模式土壤反硝化細菌的多樣性及群落結構的變化,為深入認識該種植模式下反硝化作用微生物調控機制提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1稻蝦共作模式mr試驗地位于湖北省荊州市長江大學試驗基地(30°6′N,111°54′E),屬江漢平原漬澇農田區(qū)域。該地區(qū)屬亞熱帶季風氣候,為沖積性母質發(fā)育的水稻土,年平均氣溫約16.4℃,全年≥0℃積溫6228.4℃,無霜期250d,年均降雨量1148mm,年均日照時數(shù)2000h,年太陽輻射總值約470Juf0d7cm試驗設置稻蝦共作模式(CR)和常規(guī)中稻模式(MR)兩個處理,各處理分別設置3個小區(qū),隨機區(qū)組設計,小區(qū)面積為60m稻蝦共作模式稻田從2014年由常規(guī)中稻稻田改成。水稻移栽3d后放養(yǎng)蝦苗,供試品種為‘克氏原鰲蝦’,投放密度為15.01uf07e22.50萬只uf0d7hm1.2樣品采集和保存于2016年水稻抽穗期(8月6日,田間水層高度2~5cm)取稻田表層(0uf07e10cm)土壤,采用五點取樣法,采樣點距離周圍植株5~10cm,各小區(qū)采集5份土樣均勻混合成1個樣品,除去根系、碎石及其他雜物后分為兩部分。一部分迅速用滅菌錫箔紙包裹,放入液氮罐中低溫保存,帶回實驗室后放入超低溫冰箱,-80℃保存,用于微生物研究;另一部分鮮土采用自封袋密封后帶回實驗室放入冰箱,-4℃保存,測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮,該部分剩余土風干后過100目篩測定土壤pH、堿解氮、全碳和全氮含量。1.3測定土壤pH采用電位法(水∶土=2.5∶1)測定;土壤全碳、全氮均使用元素分析儀(ECS4024,Costech,Italy)測定1.4dna提取及pcr擴增取0.25g新鮮土壤樣品,采用PowerSoil選用引物nirK1aCu(5uf0a2-ATCATGGTSCTGCCG-CG-3uf0a2)和nirKR3Cu(5uf0a2-GCCTCGATCAGRTTGTGG-TT-3uf0a2)擴增nirK基因將PCR產物回收,連接至pUC-T載體(CWBIO,北京,中國)上,轉化大腸埃希菌DH5uf061后進行培養(yǎng),選擇陽性克隆菌株提取質粒,采用核酸檢測儀檢測濃度和純度,將濃度換算成拷貝數(shù),梯度稀釋,-80℃保存,用于制備標準曲線。1.5illmumicamiseq測序參照電泳初步定量結果,將PCR產物用QuantiFluor™-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量,之后按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例的混合,然后用IllmuminaMiseq測序平臺進行雙末端測序,測序服務委托北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成。MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù),使用FLASH和Trimmomatic軟件首先根據(jù)PEreads之間的overlap關系,將成對的reads拼接(merge)成1條序列,同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾,根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列,并校正序列方向,即為優(yōu)化數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)去雜方法和具體參數(shù)設置依據(jù)楊亞東等1.6生物多樣性分析使用Usearch7.1軟件將優(yōu)質序列聚類成操作分類單元(OperationalTaxonomicUnits,OTU),按照97%相似性對重復序列(不含單序列)進行OTU聚類,采用RDPclassifier分類法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析;使用Mothur1.30.1軟件在相似水平97%上進行微生物多樣性指數(shù)評估。數(shù)據(jù)方差分析和相關性分析用SPSS20.0軟件完成,采用單因素方差分析法區(qū)分樣品間的顯著性差異(n=3,Tukey,P<0.05);利用R語言工具制作曲線圖及Pearson熱圖,利用CANOCO5.0軟件對土壤理化性質和nirK基因反硝化群落結構進行冗余分析(RDA)。2結果與分析2.1銨態(tài)氮、土壤理化指標在0~10cm土層土壤中,稻蝦共作模式(CR)土壤硝態(tài)氮、全碳、全氮含量均顯著高于常規(guī)中稻模式(MR)(P<0.05)(表1)。pHCR低于MR,差異不顯著(7.41~7.47,P>0.05);堿解氮和銨態(tài)氮含量CR均高于MR,差異不顯著(P>0.05);碳氮比CR低于MR,差異不顯著。研究結果表明,稻蝦共作模式可顯著提高水稻抽穗期稻田土壤中硝態(tài)氮、全氮及全碳的含量,對碳氮比和堿解氮、銨態(tài)氮含量沒有顯著影響。2.2土壤多樣性指數(shù)分析采用Miseqsequencing技術對微生物nirK基因測序分析,數(shù)據(jù)經過優(yōu)化篩選后6個樣品共測得原始序列209777條,序列平均長度為448.16bp,共測得堿基94009020個,所有樣品的序列長度在202~537bp(表2)。按97%的相似度對非重復序列進行OTU分析,共得到344個OTUs。對各樣本序列進行隨機抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)與它們對應的物種多樣性指數(shù),構建稀釋曲線(rarefactioncurves)。樣本Coverage指數(shù)在0.9966~0.9978,稀釋性曲線均趨于平坦飽和,表明此測序深度獲得序列數(shù)據(jù)量可以反映土壤樣品nirK基因微生物信息(圖1)。對Alpha多樣性指數(shù)進行單因素方差分析(表3),結果顯示兩處理間Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異不顯著,CR處理的Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均顯著高于MR處理。Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)是衡量微生物群落豐富度指數(shù),Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是衡量微生物群落多樣性的重要指標。結果表明,稻蝦共作模式(CR)較常規(guī)中稻模式(MR)顯著增加了稻田土壤nirK基因微生物的群落豐富度,未顯著改變nirK基因微生物群落的多樣性。2.3cr、鹽桿菌屬的比較表3在水稻抽穗期,對CR處理和MR處理nirK基因微生物進行目、科、屬、種的物種分類學水平分析(圖2)。在目水平上,CR處理和MR處理具有相同的10個目(圖2a),MR處理獨有紅螺菌目(Rhodospirillales)。在科水平上,CR處理和MR處理具有相同的15個科(圖2b),MR處理獨有紅螺菌科(Rhodospirillaceae)。在屬水平上,CR處理和MR處理具有相同的23個屬(圖2c),MR處理獨有2個屬,分別是紅螺菌目紅螺菌科的固氮螺菌屬(Azospirillum)和根瘤菌目根瘤菌科的中華根瘤菌屬(Sinorhizobium),CR處理獨有鹽桿菌目鹽桿菌科的鹽惰菌屬(Halopiger)。在種水平上,CR處理和MR處理具有相同的35個種(圖2d),MR獨有8個種,分別是紅假單胞菌屬的Rhodopseudomonas_sp._2-8、Rhodopseudomonas_palustris,中華根瘤菌屬的Sinorhizobium_sp._R-24605,根瘤菌屬的Rhizobium_sp._R-24658,包西氏菌屬的Bosea_sp._MF18,中慢生根瘤菌屬的Mesorhizobium_sp._D237c,norank_p__environmental_samples_k__norank屬的uncultured_marine_bacterium,固氮螺菌屬的Azospirillum_sp._TSH20;CR獨有2個種,分別是norank_p__environmental_samples_k__norank屬的uncultured_bacterium_d__Archaea和鹽惰菌屬的Halopiger_xanaduensis。分析表明,稻蝦共作模式改變了常規(guī)稻田模式的nirK基因微生物在目、科、屬、種水平的群落組成,較常規(guī)中稻模式,稻蝦共作模式在各分類水平組成類群均減少。2.4cr、mr算法處理優(yōu)勢目的比較兩處理所有土壤樣品獲得的nirK基因微生物物種分類在3個界、5個門、7個綱、11個目、16個科、26個屬和45個種。將無法分類的序列定義為無法歸類。兩處理所有樣品獲得的nirK基因OTUs在分類學界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為97.8%、96.0%、93.0%、89.0%、84.4%、73.3%和60.0%。在目水平上,Rhizobiales(根瘤菌目)、unclassified_k__norank_d__Bacteria、unclassified_d__Unclassified、unclassified_p__Proteobacteria和norank_p__environmental_samples_k__norank為兩處理平均相對豐度同時大于1%的5個優(yōu)勢目(圖3),CR處理3次重復平均相對豐度分別為47.0%、40.5%、6.9%、2.0%和3.0%,MR處理3次重復平均相對豐度分別為59.4%、31.7%、3.3%、3.2%和2.0%,兩處理中的優(yōu)勢目平均相對豐度差異沒有達到顯著水平(P(29)0.05)。Burkholderiales(伯克氏菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、unclassified_c__Betaproteobacteria為MR處理平均相對豐度介于0.01%~1%的目,平均相對豐度分別為0.18%、0.07%、0.06%,在CR處理中平均相對豐度分別為0.19%、0、0.35%,其中Burkholderiales和unclassified_c__Betaproteobacteria在兩處理中相對豐度沒有達到顯著性差異,CR處理缺失Rhodospirillales(紅螺菌目)。兩處理共有目的相對豐度差異不顯著,稻蝦共作模式較常規(guī)中稻模式改變了目的種類,對共有目相對豐度沒有顯著性改變。2.5植物群落分析結果對97%相似水平的OTU代表序列進行DCA分析,如果Lengthsofgradient第1軸的值大于4.0,選CCA分析;如果介于3.0~4.0,選RDA和CCA分析均可;如果小于3.0,RDA分析優(yōu)于CCA分析。分析結果中Lengthsofgradient第1軸的大小為0.906,選用RDA分析環(huán)境因子、樣本、菌群三者間的關系。RDA分析的前兩個排序軸共解釋了91.65%的群落變化(圖4),第1排序軸(RDA1)解釋了81.04%,第2排序軸(RDA2)解釋了10.61%。第1排序軸與土壤總碳(TC)、銨態(tài)氮(NH3稻蝦共作模式對鹽桿菌目和根瘤菌目的功能影響Delmont等稻蝦共作模式與常規(guī)中稻模式的微生物群落結構組成在目、科、屬、種水平上存在差異。相比MR處理,稻蝦共作模式缺失紅螺菌目、紅螺菌科、Azospirillum(固氮螺菌屬)及根瘤菌目根瘤菌科的Sinorhizobium(中華根瘤菌屬),稻蝦共作模式增加鹽桿菌目鹽桿菌科的Halopiger(鹽惰菌屬)。稻蝦共作模式缺失的紅螺菌目和根瘤菌目均具有固氮和固碳的功能環(huán)境因子與反硝化細菌群落的冗余分析(RDA)發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮含量是影響nirK反硝化細菌群落結構的主效因子。Xie等4對稻田土壤nirk基因物種目水平及群落結構的影響與常規(guī)中稻模式相比,連續(xù)3年稻蝦共作模