雞馬立克氏病廣西流行株的分離鑒定

雞馬立克?。╩d）是一種以淋巴組織增生為特征的腫瘤。由雞馬立克病病毒（mdv）引起的高度接觸和感染。依據(jù)生物學(xué)特性可將MDV分成3個血清型,只有血清1型MDV(MDV-1)具有致瘤性或致病力。MDV-1毒株之間的致病性有很大的差異,依據(jù)致病力進(jìn)一步分為4種致病型:溫和毒(mMDV)、強(qiáng)毒(vMDV)、超強(qiáng)毒(vvMDV)及特超強(qiáng)毒(vv+MDV)在與MDV致瘤性關(guān)系密切的3個特異基因132bpr、pp38和Meq中,132bpr與Meq基因是MDV-1所特有的。MDV-1的強(qiáng)弱毒株在致瘤性上的不同可能與其Meq基因有關(guān)1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒生產(chǎn)商1.2檢測meq基因的基因型參照GenBank中MDV的Meq基因序列,設(shè)計1對引物Meq1、Meq2,用于擴(kuò)增Meq基因全長序列。引物序列:Meq1:5′-ATGTCTCAGGAGCCA-GAG-3′;Meq2:5′-TTCAGGGTCTCCCGTCACC-3′。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.3pcr擴(kuò)增按DNA提取試劑盒說明書提取病料中的DNA模板,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50μL:2×TaqPCRMasterMix25μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,DNA模板10μL,ddH1.4乳酸菌葉片dh5感受態(tài)細(xì)胞的構(gòu)建將回收純化的目的片段與pMD18-TSimpleVector進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,經(jīng)初步鑒定,每個毒株隨機(jī)選取兩個陽性質(zhì)粒委托TaKaRa公司進(jìn)行核苷酸序列測定。測序后將MDV分離株Meq基因的序列登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫。1.5氨基酸序列同源性比對及進(jìn)化樹的繪制用DNAStar和BLAST軟件將測得的Meq基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中收錄的國內(nèi)外MDVMeq基因的核苷酸及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析,并應(yīng)用MegAlign軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。參考毒株信息見表1。2結(jié)果與分析2.1目的片段的測定對廣西分離株的Meq基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到了長度約1200bp的目的片段(圖1),與預(yù)期結(jié)果相符。廣西分離株的Meq基因經(jīng)克隆后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,均能得到長度約1200bp的目的條帶(圖2),表明目的基因已正確地插入到pMD18-TSimpleVector中。2.2meq基因同源性分析將挑選出的陽性克隆進(jìn)行序列測定,經(jīng)拼接后得到MDV廣西分離株Meq基因的ORF全核苷酸序列。將獲得的廣西分離株Meq基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,序列登錄號為KT229639~KT229641。Meq基因ORF全長1020bp,符合MDV的大小,編碼339個氨基酸。與國內(nèi)外參考株進(jìn)行同源性比對,3株MDV分離株Meq基因之間的同源性很高,核苷酸序列同源性為99.8%~99.9%,氨基酸同源性為99.1%~99.4%;3株分離株與國內(nèi)外MDV參考株的核苷酸序列同源性為99.2%~100.0%,其中GX15株與GXY2及YL株的同源性為100.0%,3株分離株與國內(nèi)外MDV參考毒株氨基酸的同源性為97.6%~99.7%(圖3、4)。廣西分離株與MDV參考毒株Meq基因推導(dǎo)的氨基酸在第71、77、80、115、139、176、217位氨基酸存在突變,這些位點(diǎn)分別是71(S→A)、77(K→E)、80(D→Y)、115(V→A)、139(T→A)、176(P→R)及217(P→A),大部分毒株在這些位點(diǎn)存在相似的突變。其中分離株在139、176兩處變化是近幾年國內(nèi)分離的毒株特有的。低毒力MDV具有脯氨酸重復(fù)區(qū),高毒力MDV在脯氨酸重復(fù)區(qū)有點(diǎn)突變,破壞了4個連續(xù)的P(如PPPP→PXPP),毒力越強(qiáng)發(fā)生突變的次數(shù)越多。分離株在脯氨酸重復(fù)區(qū)有2處突變(176和217位),符合高毒力毒株的變異特征。2.3meq基因測序分析及序列分析應(yīng)用MegAlign軟件繪制出不同MDV毒株Meq基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,3株分離株與國內(nèi)參考株YL、GXY2在一個分支上,與參考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。MDV不同致病型毒株的Meq基因序列相對較保守,它們相互間核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高。3株分離株與各參考株Meq基因核苷酸同源性在99.2%以上,氨基酸同源性在97.6%以上。3株突變株彼此之間核苷酸同源性在99.8%以上,氨基酸同源性在99.1%以上,與近幾年國內(nèi)分離毒株的同源性較相近,其中GX15株與國內(nèi)參考株GXY2的同源性達(dá)到100.0%。3株分離株與國內(nèi)參考株YL、GXY2在一個分支上,與參考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。目前MD的預(yù)防與控制仍需通過疫苗免疫來實(shí)行。但隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的不斷擴(kuò)大,MDV對常規(guī)疫苗的抵抗力也在逐漸增加,且能突破MD疫苗的免疫保護(hù),因此在疫苗免疫雞群中常發(fā)生野毒株的感染,且致病力也呈逐漸增強(qiáng)趨勢。廣西動物疫病預(yù)防控制中心在近年發(fā)生MD的免疫雞群分離了3株MDV,對分離株Meq基因進(jìn)行克隆和序列分析,為MDV廣西分離株遺傳變異分析和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了重要材料,也為制定MD的綜合防制措施提供了依據(jù)。MDV廣西分離株(GX15、GX36、GX74)為廣西動物疫病預(yù)防控制中心2013—2014年從廣西采集的大量可疑組織病料中分離保存的3株具有一定地方代表性的毒株。1.1.2levector公司DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、pMD18-TSimpleVector均購自TaKaRa公司;2×TaqPCRMa