發(fā)酵條件對發(fā)酵梨醋中有機(jī)酸的影響

果實醋是以水果為主要原料，通過酒精和乙酸兩個階段的發(fā)酵而成的豐富而獨特的酸性保健飲料。1材料和方法1.1實驗試劑和設(shè)備鴨梨河北省趙縣產(chǎn);安琪釀酒酵母(約220億個/g)湖北安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母1416、33133、1253、31009中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;滬釀1.01醋酸菌石家莊珍極釀造集團(tuán);巴氏醋酸菌中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;醋酸菌SG19、SG20本實驗室自篩;草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,分析純;酒石酸天津市博迪化工有限公司,分析純;奎寧酸、琥珀酸、莽草酸上海源葉生物科技公司,分析純。JYZ-E6螺桿式榨汁機(jī)九陽股份有限公司;SPX-250B-II型生化培養(yǎng)箱上海賀德實驗設(shè)備廠;LG16-B型高速離心機(jī)北京雷勃爾設(shè)備有限公司;LC-20AT液相色譜儀,配有紫外檢測器、在線脫氣機(jī)和色譜柱恒溫箱島津企業(yè)管理(中國)有限公司。1.2酒精發(fā)酵階段5.2發(fā)酵1.2.1梨汁的制備選擇新鮮無病的成熟鴨梨,清水洗凈、去核后,用螺桿式榨汁機(jī)榨汁。采用阿貝折光儀測得梨汁的糖度為11.2%。1.2.2酒精發(fā)酵1.2.2.1安琪釀酒酵母的活化配制5%的葡萄糖水,以100∶1(v/w)比例加入安琪干酵母,35℃活化40min。1.2.2.2釀酒酵母種子培養(yǎng)基2%葡萄糖,0.5%酵母粉,0.3%蛋白胨,0.2%KH1.2.2.3釀酒酵母種子液的制備在100mL釀酒酵母菌種子培養(yǎng)基中,分別接入2~3環(huán)斜面保藏的釀酒酵母1416、33133、1253、31009,30℃、180r/min搖床培養(yǎng)2d。1.2.2.4酒精發(fā)酵將150mL梨汁加入250mL的三角瓶中,并按10%接種量接入釀酒酵母種子液,用8層干凈的紗布封口,在生化培養(yǎng)箱靜置進(jìn)行酒精發(fā)酵,并采用阿貝折光儀監(jiān)測發(fā)酵液糖度。當(dāng)糖度不再明顯降低,終止酒精發(fā)酵。1.2.3醋酸發(fā)酵1.2.3.1醋酸菌種子培養(yǎng)基5%(v/v)無水乙醇、1%葡萄糖、1%酵母粉、0.2%(NH1.2.3.2醋酸菌種子液的制備將2~3環(huán)斜面保藏的滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,分別接種到100mL醋酸種子培養(yǎng)基中,30℃、180r/min搖床培養(yǎng)2d。1.2.3.3醋酸發(fā)酵酒精發(fā)酵結(jié)束后,5000r/min離心10min除去酵母菌體和果肉殘渣。按10%接種量接入醋酸菌種子液進(jìn)行靜置醋酸發(fā)酵,并采用酸堿滴定法監(jiān)測發(fā)酵液的酸度。直到酸度不再明顯升高,終止醋酸發(fā)酵。1.2.4釀酒酵母種類對梨酒有機(jī)酸的影響在150mL梨汁中,按10%接種量分別接入安琪酵母、釀酒酵母1416、33133、1253、31009種子液,28℃下靜置進(jìn)行酒精發(fā)酵。1.2.5發(fā)酵溫度對梨酒有機(jī)酸的影響按10%接種量向150mL梨汁中接入釀酒酵母1416種子液,分別在25、28、30、34℃下進(jìn)行靜置酒精發(fā)酵。1.2.6醋酸菌種類對梨醋有機(jī)酸的影響150mL梨汁中,按10%接入釀酒酵母1416種子液,28℃靜置發(fā)酵3d。酒精發(fā)酵結(jié)束后,5000r/min離心10min,制得澄清梨酒(酒精含量3.86%)。在120mL梨酒中按8%接種量分別接入滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20種子液,30℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵。1.2.7醋酸發(fā)酵溫度對梨醋有機(jī)酸的影響在120mL梨酒中按8%接種量接入滬釀1.01醋酸菌種子液,分別在25、30、34、37℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵。1.2.8醋酸發(fā)酵方式對梨醋有機(jī)酸的影響在120mL梨酒中按8%接種量接入滬釀1.01醋酸菌種子液,在30℃下分別進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵(10d)和搖床深層醋酸發(fā)酵(120r/min、8d)。1.3hplc測定1.3.3樣品預(yù)處理取5mL梨酒或梨醋,8000r/min離心10min,得到上清液。用三蒸水稀釋合適倍數(shù)后經(jīng)0.22μm膜濾后進(jìn)行HPLC測定。1.3.4有機(jī)酸定性定量方法樣品以保留時間和各有機(jī)酸紫外吸收光譜來定性,以峰面積外標(biāo)法定量。每個樣品重復(fù)3次,取其平均值。2結(jié)果與分析2.1種有機(jī)酸，對比為了研究鴨梨醋釀造過程中有機(jī)酸的變化,采用HPLC測定了鴨梨汁中9種有機(jī)酸,分析結(jié)果見表1。鴨梨汁中含有豐富的有機(jī)酸,其中含量最高的為蘋果酸,占總酸含量的52.2%;其次為草酸和奎寧酸,分別占總酸含量的18.6%和10.9%;而檸檬酸含量較少。高海燕等人2.2酒精發(fā)酵階段2.2.1釀酒酵母種類對梨酒有機(jī)酸的影響為了考察釀酒酵母種類對梨酒中有機(jī)酸的影響,本實驗使用了安琪酵母、釀酒酵母1416、33133、1253、31009釀酒酵母來釀制梨酒,并測定了其中9種有機(jī)酸的含量,分析結(jié)果見表2。由表2可見,同發(fā)酵前(鴨梨汁)相比,梨酒中的草酸、奎寧酸含量均表現(xiàn)為下降,乳酸、琥珀酸含量則均表現(xiàn)為上升,這表明5種釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中,代謝消耗了部分草酸和奎寧酸,同時產(chǎn)生乳酸和琥珀酸。在葡萄酒的酒精發(fā)酵過程中,酵母菌也會產(chǎn)生乳酸和琥珀酸從表2還可見,僅有釀酒酵母1416使得酒精發(fā)酵后的有機(jī)酸總量顯著增加,造成這種現(xiàn)象的主要原因是釀酒酵母1416大量產(chǎn)生乙酸,達(dá)到了363.74mg/100mL;安琪釀酒酵母、釀酒酵母1253、釀酒酵母31009卻使得梨酒中的有機(jī)酸顯著減少,其原因是草酸、奎寧酸、莽草酸及蘋果酸(釀酒酵母1253例外)大幅度減少;對于釀酒酵母33133而言,梨酒中的有機(jī)酸總量幾乎保持不變,而這種不變實際是幾種有機(jī)酸漲消平衡的結(jié)果。由此可見,釀酒酵母的種類對梨酒中有機(jī)酸含量有著很大的影響。選擇使用酸感良好的釀酒酵母,對于獲得風(fēng)味優(yōu)良的高品質(zhì)梨醋是非常重要的。在酒精發(fā)酵過程中,釀酒酵母1416在產(chǎn)生酒精的同時還產(chǎn)生較多的有機(jī)酸,而且其中主要是乙酸(56.0%)和蘋果酸(18.2%)。故從梨醋生產(chǎn)的角度考慮,1416為較適宜的釀酒酵母。2.2.2發(fā)酵溫度對梨酒有機(jī)酸的影響發(fā)酵溫度是影響釀酒酵母生長和產(chǎn)生酒精的重要影響因素之一。酒精發(fā)酵溫度對梨酒中9種有機(jī)酸的影響分別見圖1和圖2。如圖1、圖2所示,梨酒中乙酸、琥珀酸隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而增加,尤其是乙酸,當(dāng)發(fā)酵溫度從25℃升高到34℃時,乙酸含量從70.13mg/100mL增加到482.0mg/100mL,增加了5倍多;而蘋果酸、乳酸、奎寧酸含量則隨著酒精發(fā)酵溫度的增加而降低。蘋果酸含量的降低是由于部分蘋果酸轉(zhuǎn)化成了琥珀酸2.3醋酸菌對梨醋中的有機(jī)酸的影響2.3.1醋酸菌種類對梨醋有機(jī)酸的影響在梨酒中分別接種滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,30℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵,實驗結(jié)果見表3。如表3所示,4種醋酸菌均大量產(chǎn)生乙酸,乙酸含量占總酸比例均達(dá)到80%以上,特別是滬釀1.01氧化乙醇產(chǎn)生乙酸能力很強,其產(chǎn)酸量比其它3個菌種高一倍以上,這是由于滬釀1.01是一個米醋工業(yè)生產(chǎn)上使用的菌種。與梨酒中的有機(jī)酸相比,4種醋酸菌均使得梨醋中酒石酸含量增加,而使得檸檬酸含量降低,說明4種醋酸菌均有代謝酒石酸和檸檬酸的能力,醋酸發(fā)酵過程中消耗檸檬酸,而產(chǎn)生和積累酒石酸。除乙酸、酒石酸和檸檬酸外,梨醋中的有機(jī)酸變化因使用的醋酸菌而異。例如,巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20在醋酸發(fā)酵期間顯著地消耗了部分蘋果酸,而滬釀1.01醋酸菌卻產(chǎn)生一些蘋果酸;滬釀1.01、巴氏醋酸菌和醋酸菌SG20可產(chǎn)生部分奎寧酸,而醋酸菌SG19卻將梨酒中奎寧酸代謝殆盡。梨醋中主要有機(jī)酸也因使用的醋酸菌而異,例如,滬釀1.01梨醋的主要有機(jī)酸依次為:乙酸>蘋果酸>奎寧酸>酒石酸,而巴氏醋酸菌梨醋主要有機(jī)酸依次為:乙酸>酒石酸>蘋果酸>奎寧酸。醋酸發(fā)酵結(jié)束后,滬釀1.01發(fā)酵液總酸達(dá)到2348.4mg/100mL,有明顯的醋酸味,而其它3種醋酸菌發(fā)酵液由于總酸較少,醋酸味較淡,梨醋的品質(zhì)較差。由上述可知,醋酸菌的種類對梨醋中有機(jī)酸的代謝有顯著影響。2.3.2醋酸發(fā)酵溫度對梨醋有機(jī)酸的影響為了了解發(fā)酵溫度對梨醋釀制過程中有機(jī)酸產(chǎn)生的影響,在梨酒中接種滬釀1.01醋酸菌,分別在25、30、34、37℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵,實驗結(jié)果見圖3和圖4。作為梨醋中最主要的有機(jī)酸,乙酸含量在25~34℃范圍內(nèi)隨著發(fā)酵溫度的上升而增加;當(dāng)發(fā)酵溫度超過34℃時,梨醋乙酸含量明顯下降,這是由于醋酸發(fā)酵溫度過高時菌體老化加快,產(chǎn)酸量降低2.3.3醋酸發(fā)酵方式對梨醋有機(jī)酸的影響將滬釀1.01醋酸菌接種在梨酒中,分別進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵和搖床深層醋酸發(fā)酵,實驗結(jié)果見表4。從表4中可發(fā)現(xiàn),搖床深層發(fā)酵釀制梨醋的總酸要高于表面靜置發(fā)酵,其有機(jī)酸含量差別及對梨醋酸感的影響主要體現(xiàn)在乙酸和蘋果酸上。搖床深層發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸顯著高于表面靜置發(fā)酵,其原因是醋酸發(fā)酵是一個好氧發(fā)酵過程,搖床深層發(fā)酵可提供比表面靜置發(fā)酵更多的氧氣,而較充足的氧氣供給更有利于乙醇的轉(zhuǎn)化。從表4中還可發(fā)現(xiàn),表面靜置發(fā)酵會使得滬釀1.01合成部分蘋果酸,與之相反,搖床深層發(fā)酵卻會造成大量蘋果酸的消耗;蘋果酸酸味爽快柔和,這可能是導(dǎo)致靜置發(fā)酵梨醋風(fēng)味好于搖床發(fā)酵的原因之一。陳義倫等3酒精發(fā)酵溫度以河北特產(chǎn)鴨梨為原料釀制成梨醋,采用反相HPLC分析研究了酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵條件對梨酒和梨醋有機(jī)酸的影響,研究結(jié)果表明:a.釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中,可代謝梨汁中各種有機(jī)酸。與梨汁相比,梨酒中的草酸、奎寧酸含量均表現(xiàn)為下降,乳酸、琥珀酸含量則均表現(xiàn)為上升。梨酒中主要有機(jī)酸含量因釀酒酵母種類的不同而有很大差別。b.梨酒中乙酸、琥珀酸隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而增加,而蘋果酸、乳酸、奎寧酸含量則隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而降低。發(fā)酵溫度對梨酒的莽草酸、草酸含量影響很小。c.實驗使用的4種醋酸菌轉(zhuǎn)化乙醇生成乙酸的能力相差較大。4種醋酸菌均具有代謝各種有機(jī)酸的功能,在醋酸發(fā)酵過程中消耗檸檬酸,而產(chǎn)生和積累酒石酸。d.滬釀1.01醋酸菌的最適產(chǎn)乙酸溫度為34℃。梨醋中酒石酸、奎寧酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加。梨醋中蘋果酸和草酸的含量幾乎不受發(fā)酵溫度的影響。e.發(fā)酵方式影響乙酸的產(chǎn)生及有機(jī)酸的代謝。搖床深層發(fā)酵釀制梨醋的總酸要高于表面靜置發(fā)酵,其有機(jī)酸含量差別及對梨醋酸感的影響主要體現(xiàn)在乙酸和蘋果酸上。