雞馬立克氏病的診斷與防治

馬立克?。╩d）是雞巴組織上最常見的疾病。它是由馬立克氏病毒(MDV)引起雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤疾病,以淋巴組織的增生和腫瘤形成為特征。馬立克氏病是危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的病毒性腫瘤性傳染病。MD經(jīng)羽毛囊排毒,空氣傳播,傳染力極強(qiáng),是雞的3大主要疫病之一。該病于1907年由匈牙利病理學(xué)家JosephMarek首先報(bào)道,1961年在英國(guó)科學(xué)家Biggs的倡導(dǎo)下,開始使用馬立克病這一名稱。MD存在于世界所有養(yǎng)禽的國(guó)家和地區(qū),其危害隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化而增大,此病一旦發(fā)生,即可引起雞大批死亡,給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。MD是一種高度接觸性疾病,通過直接或間接接觸傳播,也可通過空氣傳播。在實(shí)習(xí)期間,我們確診4例MD。病雞大多表現(xiàn)為精神不振,食欲減退,羽毛松散,縮頭耷翅,雞冠和肉髯蒼白萎縮,貧血,排水樣稀便及黃白色或黃綠色下痢。病雞消瘦迅速,體重減輕,昏迷,最后衰竭死亡。通過剖檢變化,病理組織學(xué)觀察以及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),在與其他癥狀相似的疾病相鑒別后,最后確診為雞馬立克氏病。MD主要侵害外周神經(jīng)系統(tǒng),以周圍神經(jīng)、性腺、虹膜、內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚的單獨(dú)或多發(fā)的單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征MDV在細(xì)胞培養(yǎng)條件下呈一種嚴(yán)格細(xì)胞結(jié)合狀態(tài),MD的病原是在1967年由Churchill和Biggs.通過體外增殖和后來從MD腫瘤細(xì)胞分離獲得皰疹病毒才得以確定的。目前,將MDV毒株分為3個(gè)血清型。其中,引起腫瘤的MDV毒株被歸為l型,天然不致瘤的MDV為2型,而HVT毒株為3型目前,采用免疫雞群攻毒保護(hù)試驗(yàn)來判定MDV毒力的強(qiáng)弱,將血清l型MDV分為四種病原型,即溫和型(mMDV)、強(qiáng)毒型(vMDV)、超強(qiáng)毒型(vvMDV)、特超強(qiáng)毒型(vv+MDV),其中每種致病型都有特定的臨床癥狀MD是目前已知的唯一可用疫苗成功預(yù)防的病毒性腫瘤病,因而在比較醫(yī)學(xué)上,它是研究病毒性腫瘤的發(fā)生和預(yù)防機(jī)制的理想的動(dòng)物模型。MDV是一群細(xì)胞結(jié)合型的皰疹病毒科的成員,在感染細(xì)胞內(nèi)可見85~l00nm的無囊膜病毒粒子,稱為核衣殼。MDV的基因組成雙股線形DNA,長(zhǎng)度約為180kb,裸露的病毒DNA對(duì)單層細(xì)胞和易感雞都有感染性。MD的發(fā)生和嚴(yán)重程度,取決于病原、宿主和環(huán)境,這3者密切相關(guān)本病無特效藥物治療,只能依靠免疫預(yù)防。也許只有時(shí)間才能告訴我們目前家禽業(yè)所采取的措施能否會(huì)給發(fā)生突變的MDV得以逃逸及增強(qiáng)其毒力的機(jī)會(huì)1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1疾病宣言1.1.2試劑MD陽性血清、MD沉淀抗原、甲醛、酒精(95%)、二甲苯、石蠟、甘油、蘇木素、鉀明礬、鉀明礬、曙紅、NACL。1.1.3汽滅菌器、小龍蝦器、小龍蝦器、平床、架盤藥物顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、切片機(jī)、水浴鍋、座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、微量移液器、電爐、平皿、架盤藥物天平、砝碼、藥匙、量筒、燒杯、玻璃棒、紗布、漏斗、毛刷、剪子、手術(shù)刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、木塊、廢液缸、酒精燈、濾紙、樹膠、新鮮蛋白等。1.1.4瓊脂凝膠打孔器首先稱取1g瓊脂粉,加至100mL8.5%的高滲鹽水中,煮沸使之溶解(在電爐子上加熱,邊加熱邊攪拌,直到溶液由渾濁變澄清為止)。然后待溶解的瓊脂溫度降至55℃左右時(shí),將其倒入滅菌清潔的平皿中,厚度約2mm。在瓊脂凝固后,用打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔。一般的打孔器有7個(gè)孔,中心孔孔徑為3mm,周邊孔孔徑為3ml,孔距為3ml?？變?nèi)的瓊脂如未吸出,則用注射器針頭挑出。最后將平皿在酒精燈上烘烤背面(溫度不宜過高,以不燙手為宜)使瓊脂與平皿貼緊。1.1.5伊紅水溶液配制固定液配制:福爾馬林液福爾馬林(37%-40%甲醛):100ml常水:500ml蘇木素染液:第1液配方:蘇木素1g、無水酒精10ml。第2液配方:鉀明礬20g、蒸餾水200ml。第1液和第2液分別配制,第2液經(jīng)過過濾后加入第1液中,盛染液的瓶口蓋上紗布,置應(yīng)用于日光下照射約2周,經(jīng)過過濾后可以使用。伊紅水溶液的配制:伊紅(水溶性)1g、蒸餾水100ml,混合后溶解即可應(yīng)用,密封保存。1%鹽酸酒精液的配制:70%的酒精100ml、濃鹽酸1ml。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1臨床剖檢診斷將送檢的病例進(jìn)行尸體剖檢,外部檢查之后用清水將禽體羽毛浸濕,切開大腿與腹側(cè)連接的皮膚,用力將兩大腿向外翻壓直到兩髖關(guān)節(jié)脫臼,使禽體背臥位平躺。在泄殖孔前的皮膚作一條橫切線,由此切線中部沿腹中線由后向前剪開皮膚,直到喙角,使腹部和胸部皮膚分離,進(jìn)行臨床剖檢診斷。在對(duì)臨床癥狀、尸體剖檢的基礎(chǔ)上,從待檢雞的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓豐富的羽毛供實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),以尋求確診。1.2.2中心孔口的檢測(cè)采集羽髓:從被檢雞的羽毛豐厚處拔下羽毛,從羽根尖端剪下1cm左右的一段,注意要露出羽髓。加樣:取瓊脂平板1個(gè),將瓊脂平板6個(gè)孔編號(hào),分別取5根露出羽髓的羽根,直接將其插入外周1、2、3、4、5孔中,外周的第6孔中用微量移液器加入MD標(biāo)準(zhǔn)抗原,向中心孔中加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。然后將加樣完畢的瓊脂板加蓋平放于帶蓋的濕盒內(nèi),置37℃溫箱中,24h內(nèi)觀察結(jié)果。結(jié)果判定:被檢材料與中心陽性血清空之間形成清晰的沉淀線則判為陽性,否則即為陰性。1.2.3病理人類學(xué)取材固定;脫水透明;浸蠟包埋;切片貼片;修整展片;H·E染色。2結(jié)果與分析2.1病理組織學(xué)檢測(cè)組織器官:皮膚表面出現(xiàn)多個(gè)、大小不等的、灰白色的腫瘤結(jié)節(jié);心臟:表面有大小的灰白色結(jié)節(jié),稍突出于心臟表面;肝臟:明顯腫大,表面有白色小結(jié)節(jié);脾臟:彌散性腫大;腎臟:彌漫性腫大并呈灰白色;腺胃壁:增厚?？蓞⒖紙D1所示變化。2.2agp試驗(yàn)檢測(cè)中心陽性抗體的表達(dá)羽髓瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果詳見圖2。從圖2可以看出,外周2、3、4、5、6孔的羽髓與中央的陽性血清之間均形成清晰的灰白色沉淀線,證明2、3、4、5這4根羽髓的AGP試驗(yàn)為陽性,1孔未形成沉淀線,為AGP試驗(yàn)陰性,而6孔為標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原對(duì)照,檢測(cè)結(jié)果也為陽性。2.3病理組織學(xué)觀察2.2.1心臟中心心肌纖維顆粒變性、水泡變性。在血管周圍、肌纖維間、心外膜下有淋巴細(xì)胞呈浸潤(rùn)性增生。肌纖維脂肪變性,局部蠟樣壞死。2.2.2脾臟鞘動(dòng)脈周圍、淋巴小結(jié)出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞。淋巴細(xì)胞核碎裂、邊集,并見核分裂相。2.2.3中、小細(xì)胞增殖肝細(xì)胞顆粒變性、水泡變性、部分壞死。竇周隙狹窄,散在少量的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,狄氏隙擴(kuò)張。中、小淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞在靜脈周圍浸潤(rùn)。在肝小葉內(nèi)局灶性增生。增生灶內(nèi)有呈空泡狀的原始網(wǎng)狀細(xì)胞和核邊集的凋亡淋巴細(xì)胞。肝細(xì)胞壞死處有淋巴細(xì)胞集聚(詳見圖3)。2.2.4肝腎組織病理學(xué)表現(xiàn)腎小球體積增大。腎小囊腔狹窄。并有血紅蛋白樣物質(zhì)。腎小囊壁上皮細(xì)胞腫脹。局部腎小球萎縮,出現(xiàn)代償性增大。腎小管上皮細(xì)胞從顆粒變性、水泡變性到細(xì)胞壞死、胞膜破裂,整個(gè)腎小管呈均質(zhì)紅染。腎小管內(nèi)有血紅蛋白樣物質(zhì),呈尿管型(詳見圖4)。2.2.5坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維間水腫液內(nèi)散在中小淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞。局部灶性增生。2.2.6細(xì)胞內(nèi)聚合性皮質(zhì)和髓質(zhì)見有結(jié)節(jié)性或彌漫性網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞集聚。淋巴細(xì)胞核顯分裂相,局灶性增生細(xì)胞排列呈渦漩狀。部分卵泡全部被多形態(tài)淋巴細(xì)胞所代替。2.2.7胰腺胃腺小管腺細(xì)胞開始呈顆粒變性、水泡變性,逐漸壞死,腺小管內(nèi)散在流失的胞漿。淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞在腺小管間、肌層間、漿膜下浸潤(rùn)和增生。2.2.8細(xì)胞水浸和生根肌層肌細(xì)胞和腸絨毛上皮細(xì)胞變性、壞死。漿膜、漿膜下、肌層、腸腺間和絨毛固有層出現(xiàn)不同程度的大中小淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和增生。腸腺間有網(wǎng)狀細(xì)胞增生。2.2.9細(xì)胞所占的細(xì)胞血管內(nèi)、外散在淋巴細(xì)胞。血管周圍肺小葉間隔有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),局部肺泡間隔及支氣管周圍充滿大量的大中小淋巴細(xì)胞、少量的網(wǎng)狀細(xì)胞。肺小葉內(nèi)充滿淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞,局部實(shí)質(zhì)內(nèi)全被腫瘤細(xì)胞代替。3結(jié)論和討論3.1瓊氏擴(kuò)散試驗(yàn)3.1.1nm的擴(kuò)散過程羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是沉淀反應(yīng)試驗(yàn)的一種,以瓊脂凝膠作為載體,在1%以下的瓊脂凝膠中可形成大于85nm的微孔,可溶性抗原或抗體能在其中自由擴(kuò)散,并由近及遠(yuǎn)形成濃度梯度?？乖涂贵w在比例適當(dāng)處相遇,形成顆粒較大的抗原-抗體復(fù)合物而不再擴(kuò)散,出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀線。一種抗原抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀線,復(fù)合抗原中的多種抗原抗體系統(tǒng)均可以根據(jù)自己的濃度、擴(kuò)散系數(shù)、最適比等因素,形成自己的沉淀線。3.1.2加強(qiáng)檢測(cè),形成沉淀線羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不需要精密的儀器且操作簡(jiǎn)單,技術(shù)上易掌握,在我國(guó)目前條件下比熒光抗體技術(shù)和免疫電泳等易于在基層獸醫(yī)站或檢驗(yàn)室推廣應(yīng)用。羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)所形成的沉淀線不但易于攝影記錄,并可經(jīng)染色后做永久標(biāo)本。在與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的比較中,羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的陽性檢出率要高于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn);應(yīng)用本試驗(yàn)可以在同一個(gè)平皿中同時(shí)檢測(cè)多種抗原或抗體,并可就反應(yīng)后形成沉淀線的多少來辨識(shí)抗原是否純凈,因此適用于分析多種抗原成分的材料。應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的缺點(diǎn)是試驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)假陽性。3.1.3md陽性血清應(yīng)先空其腦應(yīng)多拔幾根新羽來檢查;加樣時(shí),以把孔加滿為度,切忌樣品溢出,影響判定結(jié)果;與鄰接孔連片時(shí)應(yīng)作廢處理;MD陽性血清避免反復(fù)凍融,以防降低效價(jià)而影響檢出結(jié)果;在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)時(shí),還要注意羽囊同時(shí)緣孔緊密吻合,防止羽囊徑小,邊緣孔大,否則抗原擴(kuò)散不充分,降低查檢率。3.2病理人類學(xué)3.2.1固定液的配制用于組織固定的材料必須新鮮,采集和分割后要立刻固定,不得延誤;固定材料體積的大小,以不超過直徑5㎜為準(zhǔn),材料與固定液的比例,以1∶20為準(zhǔn);所用固定液以新配的為好,并放置在陰涼處,不要在日光下直曬;材料固定完畢后,必須在容器外貼上標(biāo)簽,以防止相互混淆。3.2.2每級(jí)停留時(shí)間組織脫水是在低濃度酒精中,每級(jí)停留不宜太長(zhǎng),否則易使組織變軟,助長(zhǎng)材料的解體;在高濃度酒精中,每級(jí)停留時(shí)間也不宜太長(zhǎng),否則可使組織收縮變脆,影響切片;脫水應(yīng)徹底干凈,否則與二甲苯混合后,將呈乳白色渾濁,雖然可以倒回重脫,但效果不好;如需過夜,應(yīng)停留在70%酒精中。3.2.3封片保水性測(cè)定組織塊透明時(shí)要注意二甲苯極易揮發(fā),故在切片透明之后,從染色缸中取出封藏,手續(xù)要敏捷,不宜久置,否則待二甲苯揮發(fā)干凈后,組織就會(huì)變硬發(fā)白,即使再加樹膠封藏,由于樹膠不能浸入組織,封后也無用處;二甲苯極易吸收空氣中的水分,故在濕度大的天氣,貯有二甲苯的染色缸的蓋子周緣可涂少許凡士林,以防止水分的滲入。在封片時(shí)也不宜將口鼻過分靠近切片,以免水氣侵入,出現(xiàn)白色云霧狀;二甲苯必須保持無水無酸。若用1~2滴石蠟油滴入其中,立即出現(xiàn)云霧狀,即表示其中已含有水分,不能再用。3.2.