流式tritonx100破膜染色實(shí)驗(yàn)步驟一、溶液與試劑注：利用反滲透去離子水(RODI)或同等級(jí)別的水制備溶液。1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：配制1L的1XPBS：添加100ml10XPBS(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=12528"#12528)至900ml水，然后將其混合。4%甲醛，無甲醇(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=47746"#47746)細(xì)胞通透緩沖液：購買即用型(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=39487"#39487)或者通過添加30μlTriton?X-100至10ml抗體稀釋緩沖液來制備10ml。4°C保存?？贵w稀釋緩沖液：購買即用型流式細(xì)胞術(shù)抗體稀釋緩沖液(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=13616"#13616)，或在100ml1xPBS中溶解0.5g牛血清白蛋白(BSA)(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=9998"#9998)來制備0.5%BSAPBS緩沖液。4°C保存。推薦的二抗：要檢測(cè)未偶聯(lián)的抗體，請(qǐng)選擇與您的一抗（例如兔）的宿主物種匹配的二抗。HYPERLINK"/browse/flow-cytometry/secondary-antibodies?N=4291883758+4291883759+102287+4294956287"\t"/learn-and-support/protocols/_blank"點(diǎn)擊此處以獲取被批準(zhǔn)用于流式細(xì)胞術(shù)的二抗的最新列表。二、固定與透化注：固定前，應(yīng)分離貼壁細(xì)胞或組織，使它成為單細(xì)胞懸浮液。注：理想的離心條件根據(jù)細(xì)胞類型和試劑容量有所不同。一般，1-5分鐘150-300g將足以使細(xì)胞沉淀下來。注：如果使用全血，則需在固定前裂解紅細(xì)胞并通過離心分離來洗滌。注：如果表位被甲醛和/或Triton?X-100破壞，可以在固定前添加靶向CD標(biāo)記物或其他胞外蛋白的抗體。在固定和透化過程期間，這類抗體將保持與目的靶標(biāo)結(jié)合。如果您不確定，請(qǐng)進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。通過離心使細(xì)胞沉淀下來，移除上清液。按每100萬個(gè)細(xì)胞大約100μl4%甲醛重懸細(xì)胞。混勻以解離沉淀物并防止各個(gè)細(xì)胞交聯(lián)。室溫(20-25°C)固定15分鐘。通過離心用過量1XPBS洗滌。將上清液棄于合適的廢液缸中。在每一百萬個(gè)細(xì)胞約100μl細(xì)胞透化緩沖液中重懸細(xì)胞。在室溫孵育10分鐘。繼續(xù)進(jìn)行染色或?qū)⒓?xì)胞在PBS中-4°C保存過夜。三、免疫染色注：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或備選方法計(jì)數(shù)細(xì)胞。將所需數(shù)目的細(xì)胞分裝入試管或小孔中。（通常，每次檢測(cè)用5x105至1x106個(gè)細(xì)胞）。將細(xì)胞離心，棄去清液。在100μl稀釋的一抗中重懸細(xì)胞，這種一抗按建議的稀釋度或如通過滴定所確定那樣以抗體稀釋緩沖液配制。室溫(20-25°C)孵育1小時(shí)。在抗體稀釋緩沖液或1XPBS中通過離心洗滌。棄去上清液。重復(fù)。如果使用直接偶聯(lián)抗體，則跳到步驟9。在100μl稀釋的熒光素偶聯(lián)的二抗（按建議的稀釋比例用抗體稀釋緩沖液制備）中重懸細(xì)胞。在室溫(20