清腸溫中方對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)慢性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠氧化應(yīng)激作用的影響

潰瘍性胃炎（iu）是一種慢性非特異性炎癥疾病，可導(dǎo)致腸道粘膜和粘膜下層的持續(xù)炎癥和潰瘍，且發(fā)病率逐年升高。臨床UC患者以腹瀉、排黏液膿血便等腸道癥狀為主,可能伴有發(fā)熱、貧血等全身癥狀,并出現(xiàn)結(jié)腸息肉、結(jié)直腸癌或其他系統(tǒng)的腸外表現(xiàn)在前期發(fā)現(xiàn)清腸溫中方可以明顯改善UC患者的病情,降低疾病活動指數(shù)和修復(fù)腸黏膜,能夠減輕TNBS誘導(dǎo)的急性UC大鼠炎癥,促進(jìn)大鼠腸黏膜修復(fù)并恢復(fù)氧化/抗氧化平衡。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠慢性UC模型,觀察清腸溫中方對慢性UC小鼠氧化應(yīng)激的干預(yù)作用,為清腸溫中方尋找可能的作用新靶點(diǎn)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物及設(shè)備90只SPF級健康雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0011,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房,12h/12h光照/黑夜循環(huán),溫度(22±2)℃,濕度50%～60%,自由飲食飲水。1.3生物顯微鏡條件FinesseE切片機(jī)(Thermo);DM2000生物顯微鏡(Leica);Centrifuge5415D離心機(jī)(Eppendorf);MultiSkan3酶標(biāo)儀(Thermo)。1.4小鼠分組及分組BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,采用隨機(jī)數(shù)字表法將90只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、清腸溫中方高、中、低劑量組和美沙拉秦組,每組15只。采用改良的自由飲用3%(w/v)DSS方法復(fù)制慢性UC模型1.5各組小鼠灌胃清腸溫中浸膏方制備第43天起所有小鼠飲用蒸餾水,清腸溫中方高、中、低劑量組小鼠分別按3.2、1.6、0.8g/kg劑量灌胃清腸溫中浸膏方;美沙拉秦組小鼠按606.7mg/kg劑量灌胃美沙拉秦;模型組灌胃等體積蒸餾水;1次/d,連續(xù)14d。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄小鼠體質(zhì)量,觀察一般情況。1.6免疫組化檢測occludin蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)最后一天采用眼球取血,將小鼠一側(cè)胡須減去,充分暴露該側(cè)眼球,用眼科鑷摘除眼球,收集血液標(biāo)本,靜置1h,低溫離心機(jī)3,000r/min離心15min,收集淡黃色透亮血清,分裝后冷凍備用。在裝有碎冰的培養(yǎng)皿上距肛門7cm處向遠(yuǎn)端結(jié)腸方向取3cm標(biāo)本,近端1.5cm標(biāo)本于4%多聚甲醛溶液固定,石蠟切片包埋,4μm切片,抗原修復(fù)后采用DAB顯色法免疫組化染色觀察occludin蛋白表達(dá)。遠(yuǎn)端1.5cm標(biāo)本置于凍存管,液氮迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃?zhèn)溆谩?.6.1含量測定,即質(zhì)體質(zhì)量下降率:無下降,0分;1%～5%,1分;5%～10%,2分;10%～15%,3分;大于15%,4分。便質(zhì):正常,0分,稀軟便,2分;水樣便,4分。便潛血:陰性,0分;陽性,2分;肉眼血便,4分。1.6.3應(yīng)測定血清和組織中氧化應(yīng)激和炎癥因子的含量1.6.4occludin蛋白染色陽性運(yùn)用WCIFImageJ軟件(1.37cNIH,USA)對occludin蛋白染色陽性結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算,采用平均光密度值(AOD=IntDen/Area)代表occludin蛋白的具體染色程度。1.7單因素方差分析和等級信息檢驗(yàn)采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(ue0af±s)描述,用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),方差齊用LSD檢驗(yàn),不齊用T2檢驗(yàn)。等級資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述,用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的K-W檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1疾病活動指數(shù)檢測在造模第1周期內(nèi)小鼠癥狀表現(xiàn)明顯,病情嚴(yán)重,模型組死亡3只;清腸溫中方高劑量組死亡3只;清腸溫中方中劑量組死亡2只;清腸溫中方低劑量組死亡2只;美沙拉秦組死亡2只,小鼠體質(zhì)量明顯減輕,便質(zhì)糖稀,可呈水樣便或有黏液狀,可見肉眼血便和肛周血跡。后2個(gè)周期的癥狀表現(xiàn)較前均有所減輕,死亡數(shù)量也較前減少,在造模后2個(gè)周期內(nèi),模型組死亡3只;清腸溫中方高劑量組死亡2只;清腸溫中方中劑量組死亡3只;清腸溫中方低劑量組死亡3只;美沙拉秦組死亡3只。造模結(jié)束后的小鼠體質(zhì)量低于空白組(P<0.01),便質(zhì)細(xì)軟或稀溏、或不成形,仍有便潛血陽性,偶見肉眼血便。比較造模后疾病活動指數(shù)評分可以發(fā)現(xiàn)模型小鼠疾病活動指數(shù)明顯升高,提示模型復(fù)制成功。(見圖1)2.2各組小鼠體質(zhì)量比較隨著飲用DSS溶液時(shí)間的延長,小鼠出現(xiàn)腹瀉、黏液膿便、甚至肉眼血便的癥狀加重,同時(shí)伴有體質(zhì)量逐漸減輕,且癥狀在飲用藥物3d后明顯加重。藥物干預(yù)后除模型組外,各組小鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)并增加,治療干預(yù)期間,模型組死亡1只;清腸溫中方高劑量組死亡1只;清腸溫中方低劑量組死亡1只;清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組無死亡。本研究期間各組死亡動物數(shù)合計(jì)為:模型組7只;清腸溫中方高劑量組6只;清腸溫中方中劑量組5只;清腸溫中方低劑量組6只;美沙拉秦組5只。實(shí)驗(yàn)最后一天行體質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn),模型組小鼠體質(zhì)量低于空白組(P<0.05);清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組小鼠體質(zhì)量明顯高于模型組(P<0.01)。(見圖2)2.3各組大鼠各組組織結(jié)構(gòu)比較HE染色觀察結(jié)腸組織可見模型組腸道黏膜的常規(guī)結(jié)構(gòu)消失,隱窩結(jié)構(gòu)紊亂消失,伴較多中性粒細(xì)胞和大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,炎癥程度較嚴(yán)重,模型組評分明顯高于空白組(P<0.01)。清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組可見整齊的黏膜結(jié)構(gòu),可見清晰的隱窩和較多規(guī)律分布的杯狀細(xì)胞,中性粒細(xì)胞浸潤較少見,偶見嗜酸性粒細(xì)胞,以黏膜層為主,兩組評分均低于模型組(P<0.05)。其余各組均有好轉(zhuǎn)趨勢,組織學(xué)改變介于上述兩者情況之間,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表1、圖3)2.4mda含量的比較模型組小鼠血清GSH-Px、SOD的含量明顯低于空白組(P<0.01),而MDA的含量明顯高于空白組(P<0.01)。清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組小鼠血清GSH-px、SOD含量均高于模型組(P<0.05),而MDA含量均低于模型組(P<0.05)。(見表2)2.5mda和mpo含量測定模型組小鼠結(jié)腸組織中GSH-px、SOD含量明顯低于空白組(P<0.01),而MDA、MPO含量明顯高于空白組(P<0.01)。清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組小鼠結(jié)腸組織中GSH-px、SOD含量高于模型組(P<0.05),而MDA、MPO含量低于模型組(P<0.05)。(見表3)2.6各組均采用occludin蛋白免疫組化3氧化應(yīng)激自由飲用一定濃度的DSS溶液誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型是目前使用最廣泛且容易重復(fù)的方法,其誘導(dǎo)的動物模型癥狀方面與上皮損傷的表現(xiàn)相似,最為接近UC。當(dāng)DSS溶于水后作為一種化學(xué)毒素作用于腸上皮,破壞腸屏障,腸腔內(nèi)容物的異常進(jìn)入引起炎細(xì)胞浸潤,激活異常的免疫應(yīng)答和級聯(lián)的炎性反應(yīng)從而導(dǎo)致發(fā)病氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受有害刺激時(shí),氧化與抗氧化作用失衡,高活性氧化分子產(chǎn)生過多或消除過少,機(jī)體傾向于氧化作用,從而導(dǎo)致組織損傷的狀態(tài)此外,氧化應(yīng)激還會直接破壞腸黏膜屏障,導(dǎo)致包括機(jī)械屏障在內(nèi)的屏障結(jié)構(gòu)、功能遭到破壞本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示美沙拉秦和清腸溫中方都具有減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用,美沙拉秦主要通過抗炎、減少氧自由基而發(fā)揮療效,但研究指出,單用此類藥物容易復(fù)發(fā)且總體療效欠佳筆者推測在UC中,尤其是慢性病程階段,濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道、脾陽不足、中焦氣機(jī)不利、氣血運(yùn)化受阻導(dǎo)致腸道血敗肉腐化為膿血或引起脈絡(luò)損傷,這可能與機(jī)體腸上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、過度的炎癥反應(yīng)和偏亢的氧化反應(yīng)相類似,因此在針對該病機(jī)的清腸溫中方干預(yù)下,機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)被抑制,氧化/抗氧化平衡得以恢復(fù),發(fā)病得以控制,故而起到了治療效果。1.2藥物、藥房和科技發(fā)展有限公司清腸溫中浸膏方(黃連6g,炮姜10g,三七6g,木香6g,炙甘草6g等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供;美沙拉秦緩釋顆粒(艾迪莎,中國上海,國藥準(zhǔn)字:H20143164)購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院外購藥房;葡聚糖硫酸鈉(160110,分子量:36,000～50,000)購自美國MPBio公司;4%多聚甲醛(SL1830)購自中農(nóng)博信(北京)科技有限公司;液氮購自北京市氧利來科技發(fā)展有限公司;小鼠超氧化物歧化酶(CSB-E08556m)、谷胱甘肽過氧化酶(CSB-E13068m)、髓過氧化物酶(CSB-E08723m)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購于武漢華美生物工程有限公司;小鼠丙二醛(JL13329)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司;抗Occludin(ab31721)抗體購自美國Abcam公司。1.6.2elisa檢測小鼠腸道組織中氧化應(yīng)激及炎癥因子表達(dá)上皮損傷或潰瘍形成(潰瘍深度):0分,無潰瘍和損傷;1分,輕度(黏膜下層);2分,中度(肌層);3分,重度(漿膜層)。中性粒細(xì)胞浸潤(浸潤深度):0分,無浸潤;1分,輕度(黏膜下層);2分,中度(肌層);3分,重度(漿膜層)。淋巴、單核細(xì)胞浸潤(浸潤深度):0分,無浸潤;1分,輕度(黏膜下層);2分,中度(肌層);3分,重度(漿膜層)。嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(浸潤深度):0分,無浸潤;1分,輕度(黏膜下層);2分,中度(肌層);3分,重度(漿膜層)。評分結(jié)果是以上各項(xiàng)評分相加求和所得。將低溫保存的小鼠血清標(biāo)本37℃水浴解凍,低溫保存的結(jié)腸標(biāo)本解凍制作組織勻漿后,采用ELISA試劑盒對兩樣本中氧化應(yīng)激和炎癥因子GSH-