第七章微生物的生長及其控制課時：2學時授課方法：講解授課內容：1.微生物生長的研究方法2.微生物的生長3.環(huán)境因素對微生物生長的影響4.微生物生長的控制重點：微生物生長的研究方法；微生物的生長難點：環(huán)境因素對微生物生長的影響目的要求：1.使學生掌握微生物生長的研究方法2.掌握微生物的生長的基本過程3.理解微生物環(huán)境因素對微生物生長的影響4.了解微生物生長的控制方法參考書目：《現代生命科學概論》（黃詩箋主編）《微生物學》（武漢大學、復旦大學微生物學教研室編）《現代生物學》（胡玉佳主編）《海洋微生物及其代謝產物》（林永成主編）第一節(jié)微生物生長的研究方法

一、微生物純培養(yǎng)的分離含有一種以上微生物的培養(yǎng)稱作混合培養(yǎng)。微生物學中將在實驗條件下從一個單細胞繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。為獲得純培養(yǎng)可采用以下方法：1、顯微鏡挑取器直接挑取單個細胞進行培養(yǎng)2、稀釋涂布法或稀釋倒平板法或劃線法進行分離、純化在許多微生物發(fā)酵工藝中也常使用混合培養(yǎng)發(fā)酵，就是將幾種微生物共同接種在一個培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的發(fā)酵。此法很久以前就用于食品和飲料的生產

二、微生物的培養(yǎng)方法

微生物的培養(yǎng)方法通常根據培養(yǎng)過程對氧氣的需要與否可分為好氧培養(yǎng)與厭氧培養(yǎng)；還可根據所用培養(yǎng)基的物理特性分為固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)。(一)好氧培養(yǎng)方法1．固體培養(yǎng)方法實驗室中是將菌種接種在含有凝固劑(如瓊脂)的固體培養(yǎng)基的表面．使之暴露在空氣中生長．分為試管斜面、培養(yǎng)皿平板及茄瓶斜面等平板培養(yǎng)方法。工業(yè)生產中用麩皮或米糠等為主要原料，加水攪拌成含水量適度的半固體物料作為培養(yǎng)基，接種微生物進行發(fā)酵培養(yǎng)。2．液體培養(yǎng)方法實驗室中主要采用搖瓶培養(yǎng)法，靜置的試管液體培養(yǎng)法和三角瓶淺層培養(yǎng)法，或臺式發(fā)酵罐。工業(yè)上主要采用深層液體通氣法．多種形式的發(fā)酵罐。

(二)厭氧培養(yǎng)方法要采用各種方法去氧或放在氧化還原電位低的條件下進行培養(yǎng)。實驗室中不管是液體厭氧培養(yǎng)還是固體厭氧培養(yǎng)都需要特殊的培養(yǎng)裝置．還需要在培養(yǎng)基中加入還原劑和氧化還原指示劑。采用厭氧手套箱、Hungate滾管和厭氧罐等方法。工業(yè)上主要采用液體靜置培養(yǎng)方法。即將液體培養(yǎng)基盛于發(fā)酵罐中，在接種菌種后不通空氣靜置保溫培養(yǎng)．適于大規(guī)模機械化、連續(xù)化、自動化生產。

三、微生物的同步生長與同步培養(yǎng)方法同步生長就是指這種在培養(yǎng)物中所有微生物細胞都處于同一生長階段，并都能同時分裂的生長方式能使培養(yǎng)物中所有微生物細胞都處于相同的生長階段的培養(yǎng)方法就稱為同步培養(yǎng)法。同步培養(yǎng)的方法通常分為誘導法和選擇法兩種：

(一)誘導法誘導法就是采用物理、化學因子使微生物細胞生長進行到某個階段而停下來．使先到達該階段的微生物細胞不能進入下一生長階段．待全部群體細胞都到達該生長階段后，再除去該因子，使全部群體細胞同時進入下一個生長階段，以達到誘導微生物細胞同步生長的目的。例如，培養(yǎng)大腸桿菌胸腺嘧啶缺陷型菌株．(二)選擇法對非分支的單細胞微生物來說。處于同一生長階段的同步細胞，它們的體積和重量大致相等．處于不同生長階段的細胞．體積和重量不等。因而可用膜過濾或密度梯度離心的方法，選擇處于同一生長階段的細胞

四、微生物生長的測定方法

(一)微生物細胞數目的檢測方法1．總細胞計數法（1)血球計數板法在0.1mm3計數室內計數（2)涂片計數法0.01ml樣品涂布在1cm2載玻片上計數上述兩種方法稱為直接顯微鏡計數法，但有局限性。(3)比濁法含菌液體細胞數目越多，混濁度就越高。2．活菌計數法是通過測定樣品在培養(yǎng)基上形成的菌落數來間接確定其活菌數的方法，故又稱平板計數法。根據是在稀釋情況下一個菌落是由一個活細胞繁殖形成的。(1)涂布平板法(2)倒平板法活菌計數法需將樣品進行一系列的稀釋，靈敏度高但手續(xù)繁、需時長、影響因素多。

(二)微生物生長量和生理指標的測定方法

1．濕重法空淋后稱重2．干重法先將離心得到的細胞沉淀物置100～105℃的烘箱中干燥過夜至水分去除，然后再稱重。3．含氮量測定法一般微生物細胞的含氮量比較穩(wěn)定，可用凱氏定氮法等測其總氮量，再乘以系數6．25既為粗蛋白含量。蛋白含量越高，說明菌體數和細胞物質量越高。4．DNA含量測定方法微生物細胞的DNA含量較穩(wěn)定，故可采用適當的熒光指示劑或染色劑與菌體DNA作用，熒光比色或分光光度法測得DNA的含量。5．其他生理指標如測定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸)的含量等。

(三)絲狀微生物菌絲長度的測定方法

對于絲狀微生物。特別是絲狀真菌，通常是通過測定菌絲的長度變化來反映它們的生長速率1．培養(yǎng)基表面菌體生長速率測定法主要測定一定時間內在瓊脂培養(yǎng)基表面的菌落直徑的增加值。2．培養(yǎng)料中菌體速率測定法主要測定一定時間內在固體培養(yǎng)料(如栽培食用菌的棉子殼麩皮培養(yǎng)料)中菌絲體向前延的距離。3．單個菌絲頂端生長速率測定法可在顯微鏡下借助目鏡測微尺測定在一定時間內單個菌絲的伸長長度。第二節(jié)微生物的生長微生物的生長表現在微生物的個體生長與群體生長兩個水平上。以微生物群體作為研究對象．以微生物細胞的數量或微生物群體細胞物質量的增加作為生長的指標。要了解微生物的生長規(guī)律．就要了解微生物的個體生長和群體生長兩個方面。

一、微生物的個體生長(一)細菌細胞的生長細菌細胞的生長是指新生的細胞長大以及最后分裂為兩個子細胞的過程(二)酵母細胞的生長酵母菌細胞的生長表現為細胞體積的連續(xù)增加并在一定的間隔時間發(fā)生核和細胞的分裂，這樣一個完整的生長過程就是酵母菌的細胞周期。酵母菌細胞的分裂分為兩類，一類是不等分裂，如釀酒酵母。另一類是均等分裂，如粟酒裂殖酵母(三)絲狀真菌菌絲的生長絲狀真菌的營養(yǎng)菌絲的生長主要以極性的頂端生長方式進行。

二、微生物的群體生長

(一)無分支單細胞微生物的群體生長1．無分支單細胞微生物群體生長的特征主要包括原核生物的細菌和真核生物的酵母菌，它們的群體生長是以群體中微生物細胞數量的增加來表示的，生長速率就是指單位時間內細胞數目或細胞生物量的增加。2．無分支單細胞微生物的群體生長曲線以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌細胞數目的對數或生長速率為縱坐標作圖，可以得到的曲線，被稱為生長曲線。生長曲線代表了細菌在新的適宜環(huán)境中生長、分裂直至衰老、死亡全過程的動態(tài)變化規(guī)律。通常根據單細胞微生物生長速率的不同，將生長曲線分為遲緩期、對數期、穩(wěn)定期與衰亡期4個主要時期。

(二)絲狀微生物的群體生長

1．絲狀微生物群體生長的特征包括具分支的原核生物放線菌和真核生物絲狀真菌。絲狀生長：菌絲懸浮液的方式生長沉淀生長：沉淀物方式在發(fā)酵液中出現2．絲狀微生物群體生長曲線絲狀微生物的群體生長有著與單細胞微生物類似的規(guī)律。在深層通氣液體培養(yǎng)基中的生長曲線也顯示具有遲緩期、對數期、穩(wěn)定期和衰亡期

三、連續(xù)培養(yǎng)與微生物的生長

(一)分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)

分批培養(yǎng)是指將微生物置于一定容器的培養(yǎng)基中，經過培養(yǎng)生長．最后一次收獲的培養(yǎng)方式。

連續(xù)培養(yǎng)是在一個恒定容積的流動系統中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物(菌體和代謝產物)，以使培養(yǎng)系統中的細胞數量和營養(yǎng)狀態(tài)保持恒定，即處于穩(wěn)態(tài)。(二)連續(xù)培養(yǎng)類型連續(xù)培養(yǎng)主要有兩種類型：恒化器和恒濁器，其區(qū)別是控制培養(yǎng)基流人到培養(yǎng)容器中的方式不同。第三節(jié)環(huán)境因素對微生物生長的影響

一、溫度每種微生物都有3種基本溫度(圖7—11)最低生長溫度，低于這種溫度以下不再生長最適生長溫度，在此溫度時生長速度最快最高生長溫度，在此溫度以上不可能生長微生物的最適生長溫度通常靠近最高生長溫度根據微生物的生長溫度范圍，可區(qū)分為嗜冷微生物、嗜溫微生物、嗜熱微生物和嗜高熱微生物(圖7—12)

二、pH介質pH影響生活環(huán)境中營養(yǎng)物質的可給態(tài)和有毒物質的毒性；影響菌體細胞膜的帶電荷性質、膜的穩(wěn)定性及膜對物質的吸收能力；使菌體表面蛋白變性或水解。每種微生物都有一個可生長的pH范圍，以及最適生長pH。大多數自然環(huán)境pH為5一9,適合于多數微生物的生長。只有少數微生物能夠在低于pH2或大于pH10的環(huán)境中生長。(一)嗜酸性微生物能夠在pH5．4以下生長的微生物稱之為嗜酸性微生物。(二)嗜中性微生物生長的pH范圍為pH5.4～8.5,引起人類疾病的大多數微生物是嗜中性微生物。(三)嗜堿性微生物生長的pH范圍為pH7.0～11.5．存在于堿湖、含高碳酸鹽的土壤等堿性環(huán)境中的微生物。

三、氧微生物對氧的需要和耐受能力在不同類群中變化很大．根據它們和氧的關系可分為三類：(一)好氧微生物包括所有需要氧才能生長的微生物一類是專性好氧微生物，通常生長在培養(yǎng)基表面附近另一類是微好氧微生物．在有少量自由氧存在條件下生長最好，長在培養(yǎng)基表面之下(二)兼性好氧微生物在有氧存在下通常進行好氧代謝。但氧缺乏時可以轉變?yōu)閰捬醮x．兼性好氧微生物有兩套酶系統。一套能利用氧為電子受體．另一套在氧缺乏時能利用其他物質作為電子受體，因而在無氧或有氧條件下都可以生長。(三)厭氧微生物那些缺乏呼吸系統而不能利用氧作為末端電子受體的微生物稱之為厭氧微生物?？煞譃槟脱鯀捬跷⑸锖蛧栏駞捬跷⑸?。

四、營養(yǎng)物質的組成和濃度1、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的組成不同往往對微生物生長有很大的影響。在微生物發(fā)酵培養(yǎng)研究工作中，探討選擇合適的培養(yǎng)基組成(即合適的氮源、碳源)往往是必不可少的環(huán)節(jié)。