基于ql-1spoiie基因敲除的菌體形成及淀粉酶酶活的研究

克林波特陽性植物是一種生產(chǎn)c-li積聚酶的陽性植物。它可以產(chǎn)生各種酶，主要包括堿性酶和淀粉酶。目前國內(nèi)外多以枯草芽孢桿菌為模式菌株,對芽孢形成機制及關(guān)鍵基因進行了大量研究目前國內(nèi)外對芽孢桿菌淀粉酶產(chǎn)量方面的研究,多集中在培養(yǎng)基、工藝參數(shù)以及淀粉酶基因克隆的外源表達1材料和方法1.1實驗儀器和設(shè)備克勞氏芽孢桿菌(B.clausiiQL-1)野生菌株;pHT01質(zhì)粒用于CmZQZY-CS恒溫振蕩培養(yǎng)箱上海知楚有限公司;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Centrifuge5804R低溫冷凍離心機、4380型電轉(zhuǎn)儀德國Eppendorf公司;Veriti96孔熱循環(huán)梯度PCR儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;MD2000H核酸超微量分光光度計美國BioFure公司;UVIEssentialV6凝膠成像儀英國Uvitec公司。1.2實驗方法1.2.1引用設(shè)計spoIIE基因擴增引物spoIIEF1/spoIIER1,Cm1.2.2spoiie片段的獲得使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取B.clausiiQL-1菌體基因組,使用高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒提取pHT01質(zhì)粒,以B.clausiiQL-1菌體基因組為模板spoIIEF1與spoIIER1為引物PCR擴增獲得spoIIE片段;以pHT01質(zhì)粒為模板,Cm1.2.3同源重組片段speiie-cm將1.2.2所得的spoIIE-Cm1.2.4菌株的活化培養(yǎng)甘油管挑取一接種環(huán)B.clausiiQL-1菌液劃線于LB平板,37℃培養(yǎng)18h,反復(fù)活化兩代,挑取二代平板上的單菌落接種于15mL的LB培養(yǎng)基,37℃、200r/min培養(yǎng)12h;將菌液轉(zhuǎn)接于50mL菌體增殖培養(yǎng)基中,使初始菌液OD1.2.5同源重組片段speiie-cm將制備的B.clausiiQL-1感受態(tài)細胞與spoIIE-Cm1.2.6芽孢生成率測定B.clausiiQL-1與B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌株分別以2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃、200r/min培養(yǎng)28h,菌液于80℃水浴處理10min,將未處理的菌液與處理的菌液分別稀釋適當倍數(shù)涂布于LB固體平板上,37℃培養(yǎng)18h,平板計數(shù)法記錄并計算芽孢生成率,產(chǎn)芽孢率(%)=芽孢數(shù)/(芽孢數(shù)+營養(yǎng)細胞數(shù))×100。1.2.7ql-1spoiie生長周期及培養(yǎng)條件挑取B.clausiiQL-1與B.clausiiQL-1ΔspoIIE單菌落于15mLLB液體培養(yǎng)基,37℃、200r/min培養(yǎng)12h,將菌液轉(zhuǎn)接至100mLLB液體培養(yǎng)基至初始OD1.2.8觀察圈大小、兩相外包分別將出發(fā)菌株B.clausiiQL-1和重組菌株B.clausiiQL-1ΔspoIIE單菌落點涂于淀粉平板中央,于37℃培養(yǎng),滴加碘液觀察并測量透明圈大小。分別以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,37℃、200r/min培養(yǎng),每隔6h取樣,4℃、12000r/min離心8min取上清,按照國標GB/T24401-2009所示方法測定淀粉酶酶活,按菌體干重換算為U·g酶活定義:于60℃,pH6.0條件下,1h液化1g可溶性淀粉,即為一個酶活力單位(U·mL1.2.9b.cladio-1spie補料與未補料發(fā)酵的比較1.3處理數(shù)據(jù)本文中引物設(shè)計采用Oligo7設(shè)計,實驗采用三次重復(fù),數(shù)據(jù)由Execl處理,Origin8繪制圖形。2結(jié)果與分析2.1pcr擴增確定以B.clausiiQL-1出發(fā)菌株基因組為模板,spoIIEF1和spoIIER1為引物進行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1(a),成功獲得791bp的spoIIE片段;以質(zhì)粒pHT01為模板,Cm2.2對重組菌株的篩選和遺傳穩(wěn)定性的評價將spoIIE-Cm2.3spioie基因?qū)Πl(fā)芽和細菌體重干重的影響通過平板計數(shù)法對出發(fā)菌株及重組菌株芽孢萌發(fā)情況進行比較,結(jié)果見圖3,B.clausiiQL-1芽孢萌發(fā)數(shù)為3.93×102.4spoie菌株對淀粉水解圈的生長可溶性淀粉平板初篩,結(jié)果見圖6,重組菌株B.clausiiQL-1ΔspoIIE較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1淀粉水解透明圈明顯增大,B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌株淀粉水解透明圈與菌落直徑比為2.96,B.clausiiQL-1透明圈與菌落直徑比為1.42,可以得知重組菌株較出發(fā)菌株水解淀粉能力明顯增強。進一步對重組菌株及出發(fā)菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)并測定淀粉酶酶活,結(jié)果見圖7,B.clausiiQL-1ΔspoIIE及B.clausiiQL-1菌株發(fā)酵至84h淀粉酶酶活分別為4.8×102.5菌體干重測定對B.clausiiQL-1ΔspoIIE進行初步補料發(fā)酵,補料結(jié)果如圖8所示,菌體的生長在20~30h內(nèi)趨于平穩(wěn),30h開始補料,35h后生物量逐漸升高,對數(shù)生長期延長、生物量增大,菌體干重測定如圖9所示。由圖8和圖9可知,進行補料的B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌株OD3poiiie菌液的制備利用重疊PCR技術(shù),通過電轉(zhuǎn)化將重疊片段spoIIE-Cm將B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌液以2%接種量轉(zhuǎn)接至兩瓶1