鎘脅迫對草莓幼苗根尖氧化系統(tǒng)和dna多態(tài)性的影響

鎘（cd）是一種有毒的重金屬元素，對大多數植物、動物和微生物都有毒性作用。然而,工業(yè)“三廢”和城市生活垃圾的超標排放以及農業(yè)生產中農藥、化肥的不當使用致使我國可耕地污染日益嚴重,其中尤以城市化和工業(yè)化發(fā)展最為迅速的城郊地區(qū)最為嚴重(張慶利等,2005;郎春燕等,2006;王世斌等,2006;Caoetal.,2009)。草莓是重要的鮮食水果,果實皮薄多汁,難以長期保存,為了能減少貯運環(huán)節(jié)及時供應市場,我國草莓多在大、中城市郊區(qū)種植。因此城郊土壤環(huán)境的異常變化,是草莓生產的安全隱患(孫立榮和劉賢金,2006)。目前關于Cd對草莓傷害脅迫研究已經得到廣泛開展(Cieslinskietal.,1996;Treder&Cieslinski,2005;周碧青等,2007),草莓在低濃度的Cd存在情況下,植株無明顯毒害癥狀,但是果實中鎘含量已經超過國際食品法典委員會Cd最高限值(張金彪等,2003),這一特性可能導致因不易察覺的土壤Cd污染狀況而增加草莓產品受Cd污染風險。草莓受到Cd污染后,不僅會影響其產量和質量,更為嚴重的是Cd與其他重金屬元素相比更易在農產品中積累,并通過食物鏈危害人體健康。然而草莓種植過程中食用安全性的動態(tài)生物檢測缺乏理論基礎,尚無快速評價草莓Cd污染的方法。隨機擴增DNA多態(tài)性分析(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)已在品種分類、進化、遺傳圖譜等領域得到廣泛應用,目前應用該技術來研究污染脅迫對高等植物細胞基因組DNA多態(tài)性的影響亦初見成效(Liuetal.,2005,2009;解莉婧等,2007)。DNA增色效應指標作為判斷DNA損傷的依據在植物生態(tài)毒理領域得到廣泛應用,通過計算DNA增色效應的變化,能夠評價重金屬Cd1材料和方法1.1豐香品種zh試驗于2009年2—7月在江蘇省農業(yè)科學院園藝研究所進行,供試草莓(Fragan×ananassaDuch.)品種為‘豐香’。取露地栽培營養(yǎng)繁殖的植株為試材,待幼苗長至三葉一心時,選取長勢良好、大小一致的幼苗移至內含石英砂,直徑21cm,高15cm的盆缽里,緩苗1周后澆以400mL蒸餾水配制的1/2Hoagland營養(yǎng)液,污染物以CdCl1.2復合根本成分測定Cd處理6d后測量草莓幼苗的最大根長(每處理30株),并計算Cd對根生長的抑制率:抑制率(%)=(1-處理組平均值/對照組平均值)×100。依次用自來水和去離子水沖洗根系,并用吸水紙將表面水分吸干,收獲根尖(1cm)用于不同指標的測定。以牛血清蛋白為標準,測定可溶性蛋白質含量(Bradford,1976)。超氧陰離子()產生速率的測定按照王愛國和羅廣華(1990)的羥胺氧化法,過氧化氫(H1.3樣品處理與dna提取草莓根尖DNA提取采用改良CTAB法(Saghai-Maroofetal.,1984),取各處理DNA樣品2份,每份10μL,溶于1mL(0.08mol·L1.4rapd引物的篩選為了避免RAPD技術重復性差、不穩(wěn)定等缺點,通過3次獨立的預備試驗從30條10bp隨機引物中選出8條能夠很好的重現試驗結果的RAPD引物(購自上海英駿生物技術有限公司,序列見表1)。對每個引物制備反應混合物,并以去離子水代替模板作為負對照,50μLPCR混合液中各成分組成:2.5μL20μmol·L1.5數據分析試驗中每個處理設3次重復,取平均值用作分析,數據處理采用SPSS11.5中的ANOVA,用LSD檢驗并進行多重比較。2結果與分析2.1顯增強成分表2Cd處理抑制草莓幼苗根伸長生長,并阻礙新根的發(fā)生,隨著處理濃度的增大,抑制作用明顯增強(表2)。Cd處理同時對草莓幼苗根尖可溶性蛋白合成產生負面影響,隨著處理濃度的增加,根尖中可溶性蛋白含量下降(表2),并且Cd濃度和可溶性蛋白含量之間存在顯著負相關,表明Cd濃度與草莓幼苗根尖可溶性蛋白質含量之間存在明顯的劑量效應關系。2.2鎘處理導致氧化和氧化酶活性增加為了評價Cd對草莓幼苗造成的氧化脅迫,測定了植株根尖的產生速率和H2.3鏈間市與dna斷裂或互聯互通利用CTAB法提取的草莓根尖DNA純度在1.77~1.81(OD增色效應可反映DNA的解鏈程度,而DNA解鏈程度與其鏈長及鏈間交聯程度等有關,DNA斷裂會使鏈長變短因而增色效應提高,DNA鏈間交聯則使增色效應下降,因此依據增色效應結果可以判斷DNA是否斷裂或發(fā)生鏈間交聯等損傷效應(Koch&Giandomenico,1994)。但是斷裂和交聯的作用是相反的,如果兩者的效應相當,增色效應值也不發(fā)生改變。Cd處理后草莓幼苗DNA增色效應下降,并且存在劑量效應,當處理濃度增加到15mg·L2.4pd圖譜分析RAPD試驗所用的8條10bp寡核苷酸序列引物均可以擴增出特異穩(wěn)定的PCR產物。對照草莓根尖基因組DNA的RAPD圖譜中可分辨出88條譜帶。其分子量大小在150~3500bp之間,并且條帶清晰(表5),表明在此PCR條件下的擴增較為理想。5~15mg·L8條寡核苷酸序列引物對草莓根尖DNA的擴增效果各不相同(圖3,表5):在10和15mg·L而5、10和15mg·LRAPD譜帶的強度變化方面表現在5、10和15mg·L3dna損傷效應RAPD技術已成功地檢測出了苯并芘、重金屬、核素、雌激素等多種污染物在低劑量暴露條件下對生物細胞DNA造成的損傷和突變,與傳統(tǒng)的遺傳毒性測定方法(微核試驗、彗星分析等)相比,RAPD能檢測出生物細胞中DNA的臨時變化;而在檢測DNA模板的穩(wěn)定性方面,它比致死率、凈增殖率等經典生態(tài)學參數的敏感性更高(Atienzar&Jha,2006)。雖然該技術存在實驗結果重復性差、不穩(wěn)定等缺點,但是在篩選出合適的隨機引物和反應條件前提下,能在短時間內分析大量樣本,達到快速檢測的目的。為了克服RAPD技術的缺點,本試驗通過3次重復試驗,從30條引物(數據未顯示)中獲得8條能夠很好的重現結果的寡核苷酸引物,適用于快速評價草莓根尖早期鎘污染所造成的DNA損傷。通過它們擴增出來的PCR條帶計算基因組模板穩(wěn)定性(GST)發(fā)現,隨著Cd處理濃度的增加,GST與根長、根尖蛋白質含量的變化趨勢相同,均為穩(wěn)定下降。鎘毒害的機理可能源于與巰基的高度親和性(Schutzendubel&Polle,2002)以及Cd鎘在取代蛋白質中二價陽離子的時候釋放“自由”離子,改變植物抗氧化防御系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(Shahetal.,2001)、過氧化物酶(Araoetal.,2003)和過氧化氫酶(Schutzendubeletal.,2001)的活性,從而引發(fā)根系的氧化損傷(Yannarellietal.,2007;Smeetsetal.,2008)。本研究也獲得了類似的結果,不同濃度Cd處理后,草莓根尖SOD、POD和CAT活性下降,伴隨著活性氧爆發(fā),DNA產生交聯反應,導致DNA增色效應下降,