海南產(chǎn)守宮木安全性評價

sauropusandroginov（l）merr，sa），又名大戟科天青香、木冬、木條、越南、泰國枸杞、，在中國東南部和東南亞擁有悠久的食物歷史。郭巨先等曾對小鼠的實驗研究表明守宮木可能有一定蓄積毒性,不適宜作為蔬菜長期日常食用,這項研究結果的公布引起媒體、市民和商家的極大反響。其實早在1994年～1995年間,臺灣地區(qū)連續(xù)發(fā)生阻塞性細支氣管炎的流行和爆發(fā),多項人群流行病學的研究證實病因可能與生吃一種減肥蔬菜——守宮木有關,2005年日本學者也發(fā)表了類似病例報道。但至今關于守宮木引起阻塞性細支氣管炎的病理機制仍然不明了,動物實驗研究的報道也是眾說紛紜。為全面系統(tǒng)地評估守宮木的食用安全性,本項目組采集我國海南產(chǎn)守宮木鮮樣,采取統(tǒng)一的前處理提取方法,對其細胞毒性、遺傳毒性、亞急性和亞慢性毒性、免疫毒性等進行系統(tǒng)研究和分析。本研究從小鼠脾淋巴細胞增殖能力、細胞因子分泌功能和腹腔巨噬細胞的吞噬功能的角度,分析守宮木對免疫系統(tǒng)的影響和可能機制。1材料和方法1.1樣品與飼料的制備守宮木(Sauropusandrogynus(L)Merr,SA)于早春二月采自海南省五指山縣,經(jīng)華南師范大學生命科學學院高峰教授鑒定。守宮木嫩芽160g,加純水240ml低溫研磨,低溫超聲破碎,過濾,低溫真空濃縮得50ml提取液,回收率為86.75%,1ml提取液相當于3.2g守宮木鮮樣,0.22μ濾膜除菌后,用RPMI1640培養(yǎng)基分別稀釋成25,50,100,200,400,800和1600mg/ml濃度的受試樣品備用。SPF級BALB/C雌性小鼠,6～8周齡,體重18～22g。由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。合格證號:SCXK(粵)2006-0015,質量合格證編號:0040118。顆粒飼料由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物實驗室:SPF級,使用許可證號:SYXK(粵)2003-0011,室溫(22±2)℃;濕度50%～75%。小鼠Th1/Th2(IL-2,IL-4,IL-5,TNF,IFN-γ)CBA試劑盒(Cat:551287)和流式細胞儀(FACSCalibur)為美國BectonDickinson公司產(chǎn)品;CASYDT型快速細胞分析儀為德國SCH?RFESYSTEM公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)液為美國GIBCO公司產(chǎn)品(Cat:C22400);伴刀豆球蛋白A(ConA)為美國WorthingtonBiochemical公司產(chǎn)品(Cat:50K904J);脂多糖(LPS)為美國Sigma公司產(chǎn)品。1.2th1/th2的誘導誘導表達無菌取10只小鼠脾分別制備成單細胞懸液,用CASYDT型快速細胞分析儀計數(shù)活淋巴細胞數(shù),調(diào)整細胞濃度為6×106/ml,然后將各細胞懸液分至2塊96孔培養(yǎng)板中,其中一板進行ConA誘導的T淋巴細胞增殖反應,另一板進行LPS誘導的B淋巴細胞增殖反應,守宮木提取物終濃度分別為10、20、40、80、160和320mg/ml,ConA和LPS終濃度分別為5和1μg/ml,置體積分數(shù)為5%的CO2,37℃培養(yǎng)72h后,收集ConA誘導的T淋巴細胞增殖反應孔培養(yǎng)上清,755g4℃離心5min后取上清,使培養(yǎng)上清中所含Th1/Th2細胞因子濃度進入標準曲線濃度范圍。取連續(xù)倍比稀釋的標準品和待測樣品,按照CBA試劑盒說明書完成樣品孵育步驟并對流式細胞儀進行設置,然后用流式細胞儀和CBA分析軟件獲取數(shù)據(jù)并分析。1.3小鼠細胞中的小球物理細胞的制備參照本實驗室所建立的流式細胞術檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的方法,小鼠腹腔巨噬細胞收集及熒光微球前處理方法見文獻,收集6只BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞各2ml,細胞濃度為4～6×105/ml,分至8孔,與調(diào)理后的熒光微球分別與終濃度為0、5、10、20、40、80、160和320mg/ml的守宮木提取物37℃避光孵育2h,冷PBS洗滌1次后,70μm過濾器過濾后上流式細胞儀分析吞噬比例(PP)和吞噬指數(shù)(PI)。1.4數(shù)據(jù)分析和相關性分析實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理并分別進行非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(淋巴細胞增殖功能和細胞因子含量比較)、單因素LSD方差分析(巨噬細胞吞噬功能比較)和Pearson相關性檢驗(相關性分析)。2結果2.1組小鼠紅細胞增殖能力小鼠脾淋巴細胞在體外與守宮木提取物和ConA或LPS共培養(yǎng)72h后,10～320mg/ml劑量組淋巴細胞增殖能力均明顯低于ConA單獨培養(yǎng)對照組,劑量-反應關系明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖1)。2.2tfn-表達小鼠脾淋巴細胞在ConA刺激作用下培養(yǎng)72h后,Th1細胞因子表達水平均明顯高于Th2細胞因子,尤其是TNF和IFN-γ表達較高,Th2細胞因子均低于2.5pg/ml檢出限。與對照組比較,10～320mg/ml劑量組守宮木提取物對TNF和IFN-γ細胞因子的分泌均有明顯抑制作用,10～20mg/ml劑量組守宮木提取物可刺激IL-2表達增加,而40～320mg/ml劑量組IL-2表達又降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01,表1)。2.3tnf、ifn-表達水平與tnf、ifn-表達的相關性ConA和LPS誘導小鼠脾淋巴細胞增殖功能呈正相關,兩者均與TNF、IFN-γ表達水平呈正相關,而TNF與IFN-γ表達水平也呈正相關(P<0.01,表2)。2.4兩組pi的比較20～160mg/ml劑量組(PP)和10～320mg/ml劑量組(PI)均較對照組高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01,圖2)。3守宮木細胞毒性Lai等曾對守宮木能否引起SD大鼠發(fā)生阻塞性細支氣管炎進行了研究,結果表明守宮木不會引發(fā)SD大鼠的肺部損傷。Chang等進行的病理研究中認為淋巴細胞尤其是T細胞介導的免疫反應在守宮木誘發(fā)的阻塞性細支氣管炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用?；谝陨蠈嶒灲Y果,本研究選擇BALB/C小鼠作為實驗動物,分析了守宮木對其脾T、B淋巴細胞體外增殖功能、細胞因子分泌功能和腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響,淋巴細胞功能分析結果表明:10～320mg/ml的守宮木提取物對ConA和LPS誘導的T和B淋巴細胞增殖功能、TNF和IFN-γ的分泌均有抑制作用,且兩兩均呈正相關關系,劑量-反應關系明顯,說明守宮木體外能顯著抑制淋巴細胞的增殖和活化,劑量越高抑制作用越明顯。但有趣的是IL-2的分泌和表達結果,低劑量的守宮木提取物(10～20mg/ml)能刺激IL-2的分泌,而相對高劑量的守宮木提取物(40～320mg/ml)卻表現(xiàn)為明顯抑制作用,說明20～40mg/ml似乎是影響IL-2表達的轉折點,這種IL-2刺激性的升高表達是否與Th1細胞因子的內(nèi)部平衡狀態(tài)有關值得關注,是否可以認為20～40mg/ml劑量是守宮木對小鼠脾淋巴細胞的相對刺激劑量范圍。本項目組前期研究結果也發(fā)現(xiàn)20和40mg/ml劑量組反應很特殊,染毒24h時未觀察到細胞數(shù)量、形態(tài)與對照組有明顯差別,但在染毒48和72h時就會明顯地發(fā)現(xiàn)這2個劑量組的細胞數(shù)量特別多、細胞邊界不清楚、層次模糊和形態(tài)變異較大。后續(xù)研究需要重點對20～40mg/ml劑量間的免疫反應表現(xiàn)進一步深入探討。相比淋巴細胞的反應,守宮木對小鼠腹腔巨噬細胞的刺激劑量范圍似乎更寬,具體表現(xiàn)為:10～320mg/ml劑量范圍的守宮木提取物均能提高腹腔巨噬細胞對熒光微球的PI,但320mg/ml劑量開始呈現(xiàn)下降趨勢,巨噬細胞吞噬功能是機體防御外界損傷的第一道防線,相對低劑量守宮木能刺激其吞噬功能是否代表機體的一種自我保護能力和代償反應,也值得進一步的探討和分析。本研究結果表明巨噬細胞