新發(fā)現(xiàn)血清的蛋白質組指紋圖譜及診斷平臺的初步研究

0動態(tài)血清蛋白質組的質譜特征人類腫瘤蛋白質組的研究是當前腫瘤研究的重要方法之一。在最近的一些研究中，使用蛋白質機場質量分析技術（seldi-tof-ms）確定腫瘤蛋白質組的質量變化（指紋圖）用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。我們課題組在11個月的時間內(nèi)應用SELDI技術系統(tǒng)觀察了本組所收治的146例腫瘤患者在不同腫瘤情況下，不同病情發(fā)展階段的動態(tài)血清蛋白質組的質譜，捕捉到了一組促進腫瘤患者病情惡化的異常蛋白質組，它在質譜圖上標志醒目，指紋特征明顯，呈孤立的質譜峰簇（cluster）表現(xiàn)，與其上下游其他蛋白質組質譜峰簇的界線清楚。它具有可調(diào)控性，與腫瘤患者死亡關系密切，是一個良好的腫瘤死亡發(fā)生與否的預警蛋白質組的指紋標志。我們將其命名為LGT(losgoodwilltarget）蛋白質組?，F(xiàn)介紹LGT蛋白質組的指紋特征。1數(shù)據(jù)和方法1.1seldi檢查選擇2004年4月至2004年12月31日收治的惡性腫瘤患者146例，對患者在不同的病情、病期狀態(tài)下（手術前、手術后、化療前、化療后、放射治療前、放射治療后、重病期間、衰竭狀態(tài)）均行SELDI檢測。其中非小細胞肺癌39例、小細胞肺癌5例、食管、賁門癌22例、胃癌15例、結腸癌30例、肝癌5例、膽囊癌2例、胰腺癌3例、腎癌3例、乳腺癌17例、淋巴瘤5例。男女之比為1.98∶1。常規(guī)進行不同治療階段、不同病期的血液學、血生化及影像學檢查，記錄病情變化和當時的體征檢查情況。腫瘤特異性檢查采用ELTSA法檢測腫瘤標記物；雙抗體夾心法及流式細胞技術檢查免疫功能及淋巴因子系列；淋巴細胞AgNOR檢測。1.2seldi檢測方法1.2.1主要試劑：wc2和pbs-c美國Ciphergen（賽弗吉）公司生產(chǎn)的蛋白質指紋儀以及該公司提供的WCX2芯片和PBS-Ⅱc芯片閱讀機、閱讀軟件（ProteinChipsoftware）主要試劑為Sigma公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。其他檢查取自山西省腫瘤醫(yī)院、山西省腫瘤研究所的血液學、血生化及影像學檢查。1.2.2seldi檢驗方法1.2.2.血清樣品制備取患者晨空腹血系列血清，-80℃保存。血清標本冰浴解凍，10000r/min離心2min。取血清樣品5μL，加10μL9mol/L尿素。振蕩30min，加180μL緩沖液稀釋（100mmol/LNaOAcpH4.0）,4℃10000r/min離心2min，取上清待用。1.2.2.血清芯片的制備將芯片放入盛有100mmol/L鹽酸的試管中，振蕩4～5min,HPLC水沖洗，將芯片安裝到Bioprocessor上，每孔加200μL結合緩沖液，室溫振蕩5min，棄掉液體，重復一次。每孔上樣100μL已處理好的血清樣品，室溫振蕩1h。棄掉液體，用200μL結合緩沖液（100mmol/LNaOAcpH4.0）洗2次，每次5min，拆下芯片，待芯片自然干燥，然后每點加SPA0.5μL，兩次。干燥，用WCX2蛋白芯片閱讀儀讀芯片。[SPA=Sinapinicacid為CAN（乙腈）50%和TFA（三氟乙酸）0.5%的飽和溶液]。1.2.2.實驗數(shù)據(jù)收集設定檢樣激光強度195，檢測靈敏度8，收集數(shù)據(jù)質荷比（M/Z）范圍1.0×103～2.0×103。收集位置20～80。平均每點收集20次，收集總點數(shù)是140次。在每次實驗數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one蛋白芯片校正儀器，使之誤差<0.1%。以質量控制蛋白質芯片做重復性檢測，其峰值的大小及其強度的變異系數(shù)（CVS）均控制在0.05%和15%以下，具有良好的重復性。2結果2.1荷比m/z指紋圖譜在100%相對豐度（relativeabundance）焦平面表示的蛋白質指紋圖（見圖1），其中C2是LGT蛋白質組指紋圖，是一組質/荷比（M/Z）由11100+H至11900+H組成的質譜峰簇（cluster）樣指紋圖譜，與上游峰簇以及下游峰簇比，其M/Z約相差1000個質量單位以上，LGT蛋白質組質譜峰簇中至少有一個質譜峰相對豐度≥20%，將其放大，并拉伸觀察，該峰簇由三峰以上組成（見圖2）其放大圖見圖3[注：由于基線漂移（drift）和視覺誤差會造成約50個質量單位的漂移，因此本數(shù)值近似值相當于100個質量單位的漂移（以下同）]。3seldi指紋圖譜本研究從五個不同的角度描述LGT蛋白質組的指紋圖譜特征，研究結果表明，在采用WEX2芯片，用SELDI-TOF-MS技術檢測空腹血清，并在一焦平面上按被檢蛋白質質荷比（M/Z）大小順次記錄其含量大小（豐度———縱坐標），得出的記錄結果———蛋白質指紋圖譜上，在11100+H至11900+H之間出現(xiàn)三峰或三峰以上的質譜峰簇（cluster）是LGT蛋白質組指紋圖譜的特征，其中一個或多個質譜峰豐度≥20%，其余均在5%以上；LGT蛋白質組的質譜峰簇距上游質譜峰簇和下游質譜峰簇的質荷比（M/Z）均大于1000個質量單位，它的疑似特征是僅在11000+H至11900+H之間出現(xiàn)單峰且豐度值≥5%的指紋圖譜。SELDI(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization）技術的全稱是（SELDI-TOF-MS），即表面增強激光解析離子飛行時間（timeofflight）質譜技術，其結果是用MS（質譜計massspectrometer）在一焦平面上，按被檢物質的質荷比（M/Z）大小，順次記錄其含量的大小（豐度）進行描述。是賽弗吉（Ciphergen）公司新近推出的一種集合系列型蛋白質芯片（ProteinchipR）和激光解析電離質譜技術相結合的檢測體液技術的蛋白質分析平臺———蛋白指紋儀。其最大特征是用一組稱為Proteinchip的蛋白質芯片，在檢測前根據(jù)不同的蛋白質與芯片內(nèi)容結合方式的不同將被檢的蛋白質大致分類，進行初篩。因此這種方法簡單、易行、準確、分析簡化，最主要特征是可以進行定量蛋白質的研究。從方法學上明顯優(yōu)于目前流行的MELDI(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization）技術。SELDI技術常用的芯片有五種，即SAX2（強陰離子交換芯片）WCX2和CM10（弱陽離子交換芯片）H4（疏水表面芯片）IMAC3（固定金屬親合捕捉蛋白芯