ICS11.220CCSB41團 體 標 準T/CVMA125—2023牦牛球蟲病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforyakcoccidiosis2023-7-14發(fā)布 2023-7-14實施中國獸醫(yī)協(xié)會 發(fā)布T/CVMA125—2023前??言GB/T1請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提出。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會歸口。本文件起草單位：四川農(nóng)業(yè)大學。本文件主要起草人：謝躍、左之才、周璇、古小彬、徐璟、郭紅瑞、馬曉平。IT/CVMA125—2023牦牛球蟲病診斷技術(shù)范圍本文件規(guī)定了牦牛球蟲病的臨床診斷、病原檢查、病理檢查、綜合判定等診斷技術(shù)要求。本文件適用于牦牛球蟲病的診斷。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語及定和適用于本文件。yakcoccidiosis由球蟲寄生于牦牛腸上皮細胞所引起的以出血性腸炎為特征的急性或慢性腸道原蟲病。寄生于牦牛小腸、結(jié)腸、盲腸和直腸上皮細胞內(nèi)的一種原蟲，其卵囊呈短橢圓形或亞球形，無色，無微孔、極粒及外殘體，但有斯氏體及內(nèi)殘體，可引起以出血性腸炎為特征的急性腸道球蟲病。1：邱氏艾美耳球蟲是牦牛球蟲病致病力最強的病原種類之一。2：邱氏艾美耳球蟲卵囊形態(tài)見附錄AA.2A.1~A.2注1：牛艾美耳球蟲是牦牛球蟲病致病力最強的病原種類之一。注2：牛艾美耳球蟲卵囊形態(tài)見A.3和圖A.3~圖A.4。1T/CVMA125—2023注1：柱狀艾美耳球蟲是牦牛球蟲病主要的病原種類之一。注2：柱狀艾美耳球蟲的卵囊形態(tài)見A.4和圖A.5~圖A.6。注1：橢圓艾美耳球蟲是牦牛球蟲病主要的病原種類之一。注2：橢圓艾美耳球蟲的卵囊形態(tài)見A.5和圖A.7~圖A.8。1：阿拉巴艾美耳球蟲是牦牛球蟲病主要的病原種類之一。2：阿拉巴艾美耳球蟲的卵囊形態(tài)見A.6A.9~A.10。臨床診斷急性型慢性型病原檢查材料與試劑試劑飽和鹽水和2.5%重鉻酸鉀溶液，配制方法分別見附錄B中B.l和B.2。器材0.25mm（60目0.15mm（100目）銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)、100mL量筒、50mL燒杯、50mL離心管、10mL離心管、吸管、鑷子、天平、離心機、麥克馬斯特計數(shù)板、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。2T/CVMA125—2023樣品采集、保存和運輸糞便的采集若是群體采樣，采集牦牛新鮮糞便：成年牛群不少于300g，幼年（3歲以內(nèi)）牛群不少于100g；若是個體采樣，牦牛個體數(shù)應在20頭及以上，采集量成年牛不少于100g，幼年牛不少于50g。樣品的保存樣品的運輸以最快最直接的途徑，將所采集的樣品送往實驗室進行檢測，運輸條件應符合NY/T541—2016。操作定性檢查5g~10g50mL燒杯，加入適量自來水。0.25mm0.15mm銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾。50mL試管，600g（2500r/min）10min。10mL離心管內(nèi)。室溫（25°C）用飽和鹽水加滿離心管，蓋上蓋玻片（蓋玻片應與液面接觸）10min。10×10或10×40倍數(shù)進行鏡檢。定性檢查的判定標準如下。（群2.5%重鉻酸鉀25°C~28°CA球蟲卵囊形態(tài)特征，確定球蟲種類；5.3.1.1514d~21d，每天檢查均未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，說明該牦牛（群）未感染球蟲。定量檢查對定性檢查中呈陽性的糞樣，需進行定量檢查。310g50mL燒杯，加入適量自來水0.25mm3~50.15mm3~5次濾網(wǎng)。50mL試管，600g（2500r/min）10min，棄去上清液，沉淀用少量飽和鹽水100mL60mL處，充分混勻。25min。將麥克馬斯特計數(shù)板置于顯微鏡下，用10×10倍數(shù)計數(shù)每個計數(shù)室（lcm×1cm×0.15cm=A。每克糞便卵囊數(shù)（oocystpergram，OPG）按照公式（1）OPG。OPG＝（A÷0.15）×60÷10＝A×40 （1）3T/CVMA125—2023式中：A——5.3.2.5中計算所得的平均卵囊數(shù)。60mLB倍后計數(shù)，按照公式（2）OPG。OPG＝A×40×B （2）式中：A——5.3.2.5中計算所得的平均卵囊數(shù)；B——飽和鹽水稀釋倍數(shù)。定量檢查的判定標準如下：a）OPG>10×104，為嚴重感染；b）1×104≤OPG≤10×104，為中度感染；c）OPG<1×104，為輕度感染。病理檢查材料準備磷酸鹽緩沖液（PBS）B.3。恒溫箱（4°C~60°C）、顯微鏡（100×）、酒精燈、凸刃小刀、棉拭子、自封袋、平皿等。疑為發(fā)生球蟲感染致死或?qū)⒁劳龅年笈?。病變檢查對疑似球蟲感染致死或?qū)⒁劳龅年笈＿M行解剖，觀察腸道病變情況。發(fā)現(xiàn)腸道明顯腫大、脹氣或變形，腸漿膜面出現(xiàn)針尖大小、顏色為鮮紅色、褐色或白色的斑點裂殖子/裂殖體檢查取病變明顯的腸道（特別是大腸），縱向剪開，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗去黏膜表層的雜物，刮取少許黏膜。1~2滴磷酸鹽緩沖液，加蓋玻片，置于顯微鏡載物臺上。在高倍鏡（×100）下觀察，如見有大量球形的像剝了皮的橘子似的裂殖體（直徑大多為10μm~50μm）和香蕉形或月牙形的裂殖子[大小大多為（5μm~8μm）×（2μm~3μm）]，判為球蟲感染。卵囊檢查1~2滴磷酸鹽緩沖液，加蓋玻片，輕輕將內(nèi)容物壓散，置顯微鏡下檢查，若見大量球蟲卵囊（A.1~A.22），判為球蟲感染。4T/CVMA125—2023或取有灰白色斑點或斑塊的腸道，縱向剪開，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗去黏膜表層的雜物，刮取1~2綜合判定凡出現(xiàn)第4章的臨床癥狀或符合6.2的病變特征，可判為球蟲病疑似病例。確診凡符合6.2的病變特征，并滿足6.3或6.4中檢查結(jié)果為球蟲感染。糞便定量檢查結(jié)果滿足5.3.2.8中a）或b）或c）時，可判為球蟲病病例。5T/CVMA125—2023附 錄 A（資料性）牦牛球蟲種類及其卵囊形態(tài)特征牦牛球蟲及種類在我國，常見的牦牛球蟲病原有14種，包括邱氏艾美耳球蟲（merazuerni、牛艾美耳球蟲（merabovs、柱狀艾美耳球蟲（meriacyndrca、橢圓艾美耳球蟲（meriaepsodais、阿拉巴艾美耳球蟲（meriaaabamenss、奧博艾美耳球蟲（meriaauurnenss、巴氏艾美耳球蟲（Eimeriabareillyi（Eimeriabrasiliensis（Eimeriabukidnonensis、加拿大艾美耳球蟲（Eimeriacanadensis、伊利諾斯艾美耳球蟲（merianosenssmeriapeameriasubsphrc、（meriayomngenssA.1~圖A.22。邱氏艾美耳球蟲卵囊呈短橢圓形或亞球形，大小為（12.2μm20.0μm）×（17.7μ~19.μm，平均大小為16.05μm×14.21μm42A.1~A.2。A.1邱氏艾美耳球蟲未孢子化卵囊A.2邱氏艾美耳球蟲孢子化卵囊牛艾美耳球蟲（151μm20.5μm（210μm34.3μm19.2μm×2559m。42A.3~A.4。6T/CVMA125—2023圖A.3牛艾美耳球蟲未孢子化卵囊圖A.4牛艾美耳球蟲孢子化卵囊柱狀艾美耳球蟲卵囊呈圓柱狀或長圓柱狀，大小為（16.64μm~28.25μm）（12.87μm~20.59μm42A.5~A.6。A.5柱狀艾美耳球蟲未孢子化卵囊圖A.6柱狀艾美耳球蟲孢子化卵囊橢圓艾美耳球蟲10.0μm28.0μm10.0μm20.0μm15.7μm12.92m。42A.7~A.8。A.7橢圓艾美耳球蟲未孢子化卵囊7T/CVMA125—2023圖A.8橢圓艾美耳球蟲孢子化卵囊阿拉巴艾美耳球蟲15.4μm28.2μm）12.84m18.06μm42A.9~A.10。A.9阿拉巴艾美耳球蟲未孢子化卵囊A.10阿拉巴艾美耳球蟲孢子化卵囊奧博艾美耳球蟲卵囊較大，呈長卵圓形、橢圓或錐形，大小為（27.0μ~41.0μm）（20.5μm30.8μm，平均36.83μm×25.56μm42A.11~A.12。圖A.11奧博艾美耳球蟲未孢子化卵囊8T/CVMA125—2023圖A.12奧博艾美耳球蟲孢子化卵囊巴氏艾美耳球蟲38.2μm~26.6μm42A.13。圖A.13巴氏艾美耳球蟲孢子化卵囊巴西利亞艾美耳球蟲35.9μm38.4μm25.6μm28.1μm38.1μm26.21m。42A.14。A.14巴西利亞艾美耳球蟲未孢子化卵囊撥克朗艾美耳球蟲卵囊呈梨形，大小為（37.98μm~48.32μm）×27.57~33.65μm43.02μm~31.35μm。卵囊42A.16。A.15撥克朗艾美耳球蟲未孢子化卵囊9T/CVMA125—2023A.16撥克朗艾美耳球蟲孢子化卵囊加拿大艾美耳球蟲23.0μ~18.5μm18.0μ~25.6μm30.6μm×2267m。42A.17。A.17加拿大艾美耳球蟲孢子化卵囊伊利諾斯艾美耳球蟲26.30μm~20.7μm42個子A.18。A.18伊利諾斯艾美耳球蟲未孢子化卵囊皮利他艾美耳球蟲36.943.2μm）25.028.45μm410μm27.4μm。A.19~A.20。A.19皮利他艾美耳球蟲未孢子化卵囊10T/CVMA125—2023A.20皮利他艾美耳球蟲孢子化卵囊亞球形艾美耳球蟲10.3μm12.8μm8.9μm12.8μm5μm10.93m。42A.21。A.21亞球形艾美耳球蟲未孢子化卵囊懷俄明艾美耳球蟲40.20μm~29.00μm42A.22。A.22懷俄明艾美耳球蟲未孢子化卵囊11T/CVMA125—2023附錄B（資料性）試劑及其配制飽和鹽水稱取400g食鹽，放入燒瓶中，加1000mL蒸餾水，加熱燒瓶至沸騰，充分攪拌后冷卻至室溫，有少量鹽析出，即為飽和鹽水。2.5重鉻酸鉀溶液25g1L1000mL刻度處，充分攪拌使重鉻酸鉀完2.5%重鉻酸鉀溶液。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）將下列試劑按次序加入1000mL定量瓶中：8.00g0.20g800mL充分攪勻，用適量1mol/L鹽酸調(diào)溶液的pH至7.4，再加蒸餾水定容至1L。分裝至500mL或250mL的玻璃瓶中，在121kPa壓力下蒸汽滅菌20min，室溫保存。12T/CVMA125—2023參考文獻孔繁瑤.家畜寄生蟲學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2010.張凱慧李東方毋亞運等西藏部分地區(qū)牦牛球蟲感染情況的調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科學,2019,49(9):1160-1166.賀安祥,蔣忠榮,葉忠明,等.牦牛球蟲病的流行病學調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī),200936(6):154-156.高曼.關(guān)中地區(qū)牛球蟲種類和安氏隱孢子蟲基因分型研究[D].陜西:西北農(nóng)林科技大學2013.Florin-ChristensenM,SchnittgerL.Parasiticprotozoaoffarmanimalsandpets[M].