肝在實(shí)驗(yàn)性內(nèi)毒素血癥中的免疫調(diào)節(jié)作用

腫瘤壞死因子（tnf）是一個(gè)重要的因素。在動(dòng)物體內(nèi)，單個(gè)細(xì)胞主要受致病性微生物、寄生蟲(chóng)和毒素的刺激。它具有廣泛多樣的生物活性，不僅是免疫效應(yīng)的材料，也是免疫調(diào)節(jié)的分子。一方面它可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)某些病毒感染細(xì)胞的凋亡,另一方面可廣泛激活機(jī)體免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1),增強(qiáng)組織MHC-Ⅰ類分子的表達(dá),誘導(dǎo)肝臟急性期反應(yīng)蛋白的合成。近年的研究表明,內(nèi)毒素血癥在肝硬化、急性肝衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其中由激活的枯否細(xì)胞分泌的TNF-α是一種重要的介質(zhì)。為了探討在內(nèi)毒素血癥,特別是腸源性內(nèi)毒素血癥中肝臟TNF-α的分泌特點(diǎn),本研究在山羊采用慢性多血管插管的方法,經(jīng)不同途徑灌注細(xì)菌脂多糖,觀測(cè)了TNF-α水平的動(dòng)態(tài)變化。材料和方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17只當(dāng)?shù)匦坌匀?shì)山羊,購(gòu)自江蘇省溧水縣農(nóng)戶,體重(16.75±1.79)kg,年齡1-2歲,自由飲水,飼以刈割的青干草。2術(shù)后全麻處理所有的動(dòng)物自購(gòu)入后經(jīng)1周以上的正常飼養(yǎng)。術(shù)前動(dòng)物禁食24-36h,右側(cè)腹壁剪毛消毒,肌注氯胺酮(1mg/kg)誘導(dǎo)麻醉,10min后再肌注速眠新(解放軍軍需大學(xué)生產(chǎn))0.5mL進(jìn)行全麻。左側(cè)臥固定,首先裝置頸靜脈插管。右側(cè)軟腹壁采用普魯卡因局部麻醉,手術(shù)開(kāi)腹,順序裝置肝靜脈和門靜脈插管。各插管內(nèi)充滿1∶400的肝素鈉滅菌生理鹽水溶液?？p合創(chuàng)口。術(shù)后每日肌注青霉素160萬(wàn)單位,鏈霉素200mg,并更換管內(nèi)液體1次,連續(xù)4d。術(shù)后第5d進(jìn)行脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)灌注實(shí)驗(yàn)。3織物灌注前血樣采集LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,提取自O(shè)55:B5型大腸桿菌。用前以滅菌生理鹽水配制成兩種濃度:①2×104內(nèi)毒素單位(EU)/L;②3mg/L,相當(dāng)于1.5×106EU/L。本試驗(yàn)分3組進(jìn)行:組①經(jīng)門靜脈灌注低劑量LPS(20EU/kg體重),共5例;組②經(jīng)頸靜脈灌注低劑量LPS(20EU/kg體重),共5例;組③經(jīng)頸靜脈灌注高劑量LPS(1500EU/kg體重),共7例。受試動(dòng)物于灌注LPS前分別采集頸靜脈、門靜脈及肝靜脈血,作為灌注前血樣,LPS溶液預(yù)熱到接近體溫時(shí)進(jìn)行灌注,保持緩慢而均勻的灌速,于15min內(nèi)灌完。灌注后1、2、3、5、8h通過(guò)各血管插管采集頸靜脈、門靜脈和肝靜脈血樣,肝素抗凝,1500r/min離心15min分離血漿,-20℃保存待測(cè)。采樣的同時(shí)還用直腸體溫計(jì)測(cè)定了直腸溫度,插入深度約8cm。4中心操作要點(diǎn)中心TNF-α水平的測(cè)定采用放射免疫分析法,試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心,批內(nèi)誤差為5%,批間變異系數(shù)為8%,操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用BasicStatistics5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)運(yùn)算,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,差異顯著性檢驗(yàn)采用t-檢驗(yàn)法。結(jié)果1灌注lps前后大鼠的服刑狀況在組①及組②,灌注LPS后動(dòng)物的精神狀態(tài)未見(jiàn)明顯改變;但直腸溫度有不同程度的變化;在組①,1h時(shí)直腸溫度出現(xiàn)上升趨勢(shì),變化幅度為0.61℃;在組②,1h時(shí)直腸溫度顯著升高(P<0.05),升高的幅度為1.02℃。在組③,灌注LPS后動(dòng)物的精神狀態(tài)有明顯改變,表現(xiàn)為精神沉郁,食欲、飲欲消失,腹脹,4h時(shí)精神狀態(tài)恢復(fù);直腸溫度較灌注前有極顯著的升高(P<0.01),上升幅度為1.36℃。2血漿tnf-i水平動(dòng)態(tài)變化2.1變化過(guò)程中的變化圖1顯示組①頸靜脈、門靜脈及肝靜脈血TNF-α水平的變化過(guò)程。結(jié)果表明,與灌注前相比,頸靜脈、門靜脈及肝靜脈血TNF-α水平未出現(xiàn)顯著變化(P>0.05),僅肝靜脈和門靜脈血TNF-α水平在3-5h出現(xiàn)上升趨勢(shì)。2.2lps后zs-bs的變化圖2顯示組②TNF-α水平的變化過(guò)程。灌注LPS后各靜脈血出現(xiàn)不同程度的波動(dòng)性變化(P>0.05),其中頸靜脈血在1h出現(xiàn)上升趨勢(shì),門靜脈血在0-8h出現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)。2.3灌注前后肝靜脈血tnf-的變化圖3顯示組③頸靜脈、肝靜脈和門靜脈血TNF-α水平的變化過(guò)程。LPS灌注后1h頸靜脈、肝靜脈及門靜脈TNF-α水平均有迅速升高,并達(dá)到峰值,其值分別是(0.760±0.052)μg·L-1、(0.820±0.050)μg·L-1和(0.711±0.071)μg·L-1,較灌注前分別上升了0.311μg·L-1、0.353μg·L-1和0.260μg·L-1,以肝靜脈血TNF-α上升幅度最高;1h之后,各靜脈血漿TNF-α水平迅速降低,至4h降到接近灌注前的水平,4-8h期間頸靜脈及門靜脈血中TNF-α的濃度繼續(xù)下降而肝靜脈血的則稍有升高。與灌注前比較,灌注后1-2h頸靜脈、肝靜脈及門靜脈均出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)(圖3)。在8h時(shí),肝靜脈TNF-α水平仍然顯著高于同時(shí)間點(diǎn)頸靜脈和門靜脈(P<0.05)。低劑量lps時(shí)肝臟tnf-變化的變化TNF-α的動(dòng)態(tài)變化是LPS刺激后極為重要的觀察指標(biāo)。小鼠的在體研究表明,肝臟Kupffer細(xì)胞是LPS誘導(dǎo)下TNF-α產(chǎn)生的重要來(lái)源,用Kupffer細(xì)胞特異性阻斷劑可使LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生下降90%左右,表明了肝臟的重要免疫調(diào)節(jié)機(jī)能。大量在體研究表明,機(jī)體在LPS靜脈灌注或腹腔注射后,TNF-α在60-90min呈現(xiàn)迅速而暫時(shí)的分泌高峰。但這一結(jié)論多數(shù)來(lái)自頸靜脈和尾靜脈的灌注和采樣。在慢性實(shí)驗(yàn)條件下,采用多血管插管以不同途徑、不同劑量尤其是低劑量灌注LPS對(duì)TNF-α影響的報(bào)道尚未見(jiàn)到。本結(jié)果表明,不同劑量、不同途徑給予LPS后,肝靜脈血中TNF-α呈現(xiàn)出不同的動(dòng)態(tài)變化。在TNF-α的反應(yīng)時(shí)程上可見(jiàn),經(jīng)門靜脈灌注低劑量LPS后,肝靜脈血和門靜脈血中TNF-α在5h出現(xiàn)上升趨勢(shì),而不是在1h,此種滯后現(xiàn)象的本質(zhì)尚不清楚。由于從門靜脈注入的LPS首先進(jìn)入肝臟,而肝臟又是體內(nèi)LPS滅活的主要器官,進(jìn)入肝臟的小劑量LPS將大部分通過(guò)吞噬或吞飲被肝內(nèi)組織特別是枯否細(xì)胞清除,推測(cè)僅有極少量的LPS跨越肝臟經(jīng)肝靜脈進(jìn)入體循環(huán)靜脈,而經(jīng)頸靜脈進(jìn)入的LPS則可首先作用于血液內(nèi)游離的單核細(xì)胞,引起TNF-α的分泌,因此灌注LPS的途徑不同,將引起不同的TNF-α分泌動(dòng)態(tài)。其次,LPS作用于肝臟的時(shí)間也是要考慮的問(wèn)題。正常情況下血液中存在著能與LPS結(jié)合的物質(zhì),如脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein,LBP)、游離CD14、高密度脂蛋白等,這些物質(zhì)有的能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,有的能促進(jìn)LPS的清除。經(jīng)門靜脈灌注與經(jīng)頸靜脈灌注時(shí),推測(cè)LPS在與肝臟細(xì)胞作用前與血液中上述物質(zhì)結(jié)合的時(shí)間不同,結(jié)合率及結(jié)合物種類亦有差異,導(dǎo)致TNF-α釋放動(dòng)態(tài)的不同。第三,考慮到組①中肝靜脈及門靜脈血中TNF-α的滯后性升高,我們推測(cè)小劑量LPS作用于肝臟時(shí),肝臟釋放了某種未知因子,抑制了肝臟及門靜脈匯流區(qū)(腸道和脾)TNF-α的釋放。其中一個(gè)可能的因素是IL-6。IL-6有顯著的抑制TNF-α釋放的作用。劉為民等在山羊觀測(cè)到從頸靜脈灌注大劑量LPS時(shí),肝靜脈血、門靜脈血和頸靜脈血中TNF-α和IL-6的反向變化趨勢(shì)。Moeniralam等也發(fā)現(xiàn)門靜脈灌注LPS可誘導(dǎo)出IL-6的凈產(chǎn)生,而外周靜脈灌注LPS則難以誘導(dǎo)肝臟分泌IL-6。推測(cè)小劑量LPS作用于肝臟時(shí),肝臟釋放了IL-6,抑制了肝臟及門靜脈匯流區(qū)(腸道和脾)TNF-α的釋放。經(jīng)頸靜脈灌注大劑量的LPS后,各靜脈血中TNF-α水平而肝在1h同時(shí)達(dá)到了峰值,1h后下降