刺梨莖尖超低溫保存技術(shù)研究

羅地亞-溫佩其斯特利斯特利斯是中國獨(dú)特的開發(fā)潛力和可接近的現(xiàn)代養(yǎng)分健康水果。刺梨資源豐富,其保存主要以田間種植保存為主,但這種方式難以避免自然災(zāi)害、病蟲危害以及人為破壞,而常規(guī)離體保存又存在經(jīng)常繼代、容易污染以及試管苗變異等問題。目前超低溫保存被認(rèn)為是植物種質(zhì)資源長期穩(wěn)定保存的最理想方法,已成功保存許多果樹種質(zhì)資源[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11],但刺梨超低溫保存技術(shù)體系尚未建立。我們以刺梨為材料,研究影響刺梨莖尖超低溫保存的一些因素,以期為刺梨種質(zhì)資源長期穩(wěn)定保存提供新的方法。1材料和方法1.1ghii接種法材料為貴州大學(xué)喀斯特山地果樹資源研究所刺梨資源圃內(nèi)‘貴農(nóng)5號(hào)’刺梨(Rosaroxburghii‘Guinong5’)。選取健壯、帶有腋芽的莖段,剪成長為1~2cm小段,用洗滌劑洗去外植體表面上的污漬,用自來水洗凈,然后在超凈臺(tái)上用0.1%的升汞滅菌8min,再用無菌水清洗3~4次,接種于不同培養(yǎng)基中,重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,每天光照14h。1.2玻璃法保存1.2.1植物葉片蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)莖尖蔗糖濃度的影響選擇腋芽生長健壯的無菌試管苗,切取長度約0.5cm的腋芽莖尖,接種于MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA培養(yǎng)基中,開展不同蔗糖濃度(0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol·L-1)和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(0、1、2、3、5、7d)的單因子試驗(yàn),其中不同蔗糖濃度試驗(yàn)中莖尖預(yù)培養(yǎng)為3d,不同時(shí)間預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)中蔗糖濃度為0.3mol·L-1,均重復(fù)3次。1.2.2冷凍管生長預(yù)培養(yǎng)后,在解剖鏡下剝?nèi)『?~2個(gè)葉原基的莖尖,長度約為2mm,轉(zhuǎn)移于1.8mL冷凍管中,每管10個(gè)莖尖。室溫下在經(jīng)過高溫滅菌的LS裝載液(MS+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖)中處理不同時(shí)間(0、20、30、40、50、60min),重復(fù)3次。1.2.3不同時(shí)間液氮液的制備經(jīng)過以上處理后的莖尖,用玻璃化液PVS2(MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mo1·L-1蔗糖)于0℃處理不同時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60、70min),再將莖尖轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的裝有新鮮玻璃化液PVS2的冷凍管中,然后將冷凍管裝在金屬套上,套上一根細(xì)線,最后將凍存管迅速投入液氮中保存。每處理2管,重復(fù)3次。1.2.4ms0.3mol-1-4和ms-1a/o的恢復(fù)培養(yǎng)基的制備保存24h后,從液氮中取出冷凍管,在40℃水浴鍋中化凍,用MS+1.2mol·L-1蔗糖+100mg·L-1Vc+0.5mg·L-1GA3培養(yǎng)基洗滌2次,每次10min。然后取出莖尖,用無菌濾紙吸去殘留洗滌液,轉(zhuǎn)接到MS+0.3mol·L-1蔗糖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1d,然后接種到MS+0.1mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖的恢復(fù)培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。20d左右統(tǒng)計(jì)成活率(轉(zhuǎn)為綠色,伸長的莖尖占全部試驗(yàn)莖尖數(shù)的百分率)2結(jié)果與分析2.1莖段組內(nèi)部的化程度不同培養(yǎng)基上刺梨腋芽萌發(fā)率都超過90%(表1),各處理間差異不顯著。但各培養(yǎng)基中芽的質(zhì)量、長勢(shì)以及莖段基部愈傷化程度有明顯差異,其中處理1和處理4的芽長勢(shì)好,芽大,健壯(圖版-A),但后者莖段基部愈傷化嚴(yán)重。而處理2和處理3芽長勢(shì)中等,芽較小。通過預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),生長健壯的芽,其莖尖超低溫保存再生成活率高,因此,從莖尖生長情況來看,適合超低溫保存材料誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂。2.2-ba濃度對(duì)莖尖成活率的影響切取長度約2mm的無菌苗腋芽莖尖,轉(zhuǎn)接到含有不同濃度6-BA和0.05mg·L-1IAA的MS培養(yǎng)基上,結(jié)果表明(表2),不同濃度6-BA對(duì)刺梨莖尖的生長有很大影響。當(dāng)6-BA濃度為0.1mg·L-1時(shí),莖尖成活率最大,為91.1%,與其他各處理相比達(dá)到極顯著水平,且莖尖生長良好。隨著6-BA濃度的繼續(xù)增加,莖尖成活率大幅度下降,當(dāng)6-BA濃度升至1.5mg·L-1及以上時(shí),該培養(yǎng)基中莖尖成活率低于未添加6-BA時(shí)的莖尖成活率,且莖尖長勢(shì)一般。結(jié)合莖尖成活率及生長情況,以MS+0.1mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA的組合適合刺梨微莖尖的生長。在接種30d后,就可從2mm左右,發(fā)育成健壯綠苗,長勢(shì)良好,可進(jìn)行生根與移栽。該結(jié)果可以為冷凍后材料的恢復(fù)生長奠定技術(shù)基礎(chǔ)。2.3蔗糖濃度對(duì)moll-1的影響預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度對(duì)刺梨莖尖超低溫保存后的成活率有很大的影響。由圖1可知,隨著預(yù)培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加,莖尖成活率呈先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖濃度為0.3mol·L-1時(shí),保存效果最好,成活率達(dá)37.4%,但與蔗糖濃度為0.4mol·L-1時(shí)的莖尖成活率36.5%沒有顯著差異。當(dāng)隨著蔗糖濃度的進(jìn)一步增加,莖尖成活率迅速下降,當(dāng)蔗糖濃度為0.7mol·L-1時(shí),成活率僅有15.5%,其原因可能是蔗糖濃度過高,細(xì)胞產(chǎn)生了滲透脅迫,使細(xì)胞受損所致。而0.3mol·L-1與0.4mol·L-1濃度的蔗糖可很好地增強(qiáng)細(xì)胞的滲透性及降低分生組織的水分含量。綜合考慮預(yù)培養(yǎng)的蔗糖最適濃度為0.3mol·L-1。2.4預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)刺梨莖尖成活率的影響由圖2可以看出,在MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+0.3mo1·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的刺梨莖尖隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長,莖尖成活率先增加后降低。預(yù)培養(yǎng)3d效果最好,莖尖成活率達(dá)40.1%,顯著高于其他各處理;可見,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)刺梨莖尖超低溫保存成活率有顯著的影響,但預(yù)培養(yǎng)時(shí)間要適宜,過短脫水不充分,過長細(xì)胞脫水過渡,均會(huì)導(dǎo)致成活率下降。因此,用0.3mol·L-1蔗糖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),其最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d。2.5ls裝卸液預(yù)處理對(duì)超低溫保存效果的影響裝載預(yù)處理是一個(gè)滲透保護(hù)的處理過程,可以初步降低組織的含水量,避免由于滲透壓變化太強(qiáng)而對(duì)材料造成傷害。圖3結(jié)果顯示,LS裝載液預(yù)處理對(duì)超低溫保存效果有明顯的影響。不經(jīng)過裝載液處理的莖尖幾乎不能成活,當(dāng)裝載處理時(shí)間為50min時(shí),成活率高達(dá)41%,裝載處理時(shí)間為60min時(shí),成活率下降為28.6%?？梢?裝載液預(yù)處理是刺梨莖尖的玻璃化法超低溫保存必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié),刺梨莖尖以在LS裝載液中處理40~50min效果較好。2.6刺梨莖尖在不同時(shí)間下的存活率及成活率將經(jīng)過裝載預(yù)處理50min的莖尖,在0℃處理0~70min(圖4),結(jié)果表明,隨著處理時(shí)間的增加,刺梨莖尖的成活率呈先增大后減小的趨勢(shì)。未經(jīng)處理的,保存后莖尖全部死亡;當(dāng)處理時(shí)間為40min時(shí),刺梨莖尖的保存成活率最高,達(dá)47.2%,顯著高于其他各處理;當(dāng)處理時(shí)間為70min時(shí),成活率降為30.6%,原因可能是PVS2的過度脫水及處理時(shí)間過長對(duì)材料造成傷害所致。由此可知,PVS2處理對(duì)刺梨莖尖玻璃化法超低溫保存的成功至關(guān)重要,處理時(shí)間準(zhǔn)確把握,可使莖尖成活率達(dá)到其最高水平,其最佳處理時(shí)間為40min。2.7a+30gl-1蔗糖+7gl-1相結(jié)合物的培養(yǎng)解凍后,將莖尖接種到恢復(fù)培養(yǎng)基MS+0.1mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂上,莖尖保存成活率為44.3%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),接種2d后大部分莖尖基部綠色褪去,變?yōu)楹稚?7d后成活的莖尖轉(zhuǎn)為綠色(圖版-B),大部分莖尖伸長,直接成苗(圖版-C),一定時(shí)間后個(gè)別植株生根(圖版-D),而個(gè)別轉(zhuǎn)綠莖尖則形成愈傷組織。3材料的預(yù)處理。在已經(jīng)設(shè)置時(shí),各在植物莖尖超低溫保存研究中,大多以繼代苗的莖尖作為保存材料,可能是因?yàn)橥ㄟ^繼代培養(yǎng)可以提高細(xì)胞分裂與分化的同步化頻率,從而提高超低溫保存的存活率。但本研究中,刺梨繼代苗的莖尖長勢(shì)弱,莖尖不明顯,而采用初代誘導(dǎo)苗的腋芽大、健壯,莖尖明顯,適合作超低溫保存材料,這在葡萄、柿離體莖尖超低溫保存中,也發(fā)現(xiàn)頂芽莖尖保存后不易成活,而腋芽莖尖保存后再生率較高的現(xiàn)象。要使保存后的莖尖能夠成活,莖尖的大小要適當(dāng)。過大不利于脫水,過小易造成機(jī)械損傷。因此,在剝?nèi)∏o尖時(shí),一定要盡量減少機(jī)械損傷,這也是刺梨保存成功的關(guān)鍵。本試驗(yàn)切取刺梨莖尖長度為2mm左右,保存效果較好。一般情況下,在進(jìn)行植物莖尖超低溫保存前,對(duì)材料進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),可以提高超低溫保存后的成活率。用高濃度的蔗糖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)是較為常用的方法,但本研究先期僅選用高濃度蔗糖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),保存效果不好,成活率低。而改用高濃度蔗糖結(jié)合低溫(4℃)對(duì)刺梨莖尖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),保存效果較好。預(yù)培養(yǎng)除了要求方法適當(dāng)外,預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間也要適宜。本研究預(yù)培養(yǎng)3d,保存效果較好,而預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過長或過短,則成活率都會(huì)降低,這與前人研究結(jié)果一致。此外,蔗糖濃度過高或者預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過長,材料會(huì)出現(xiàn)黃化、水漬化和生活力降低甚至死亡的現(xiàn)象,可能是由于材料脫水過度、細(xì)胞產(chǎn)生了滲透脅迫所致。本研究發(fā)現(xiàn),在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)不進(jìn)行暗培養(yǎng)