第十章微生物與基因

工程一、歷史回顧40年代－－明確DNA是遺傳物質(zhì)50年代－－DNA雙螺旋模型，半保留復(fù)制60年代初－－中心法則，操縱子70年代第一節(jié)基因工程概述關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)突破

1，DNA分子切割與連接技術(shù)2，載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系建立3，Southern雜交，DNA序列分析和PCR反應(yīng)意義；基因工程的定義指對(duì)遺傳信息的分子操作或施工，按照人的意愿，把分離到的或合成的基因經(jīng)過(guò)改造，插入載體中，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基因產(chǎn)物或產(chǎn)生生物新的性狀?；蚬こ痰幕具^(guò)程（1）目的基因的獲得動(dòng)物，植物，微生物中提取反轉(zhuǎn)錄mRNAcDNA化學(xué)合成（2）優(yōu)良載體的選擇一個(gè)復(fù)制子,能大量增殖分子量比較小多種酶單一切點(diǎn)有選擇性標(biāo)記原核生物－－質(zhì)粒，噬菌體，真核生物－－SV40(動(dòng)物），Ti(植物）.（3）目的基因與載體DNA體外重組

限制酶切割產(chǎn)生黏性末端，人工接頭低溫退火在連接酶作用下共價(jià)結(jié)合－－雜種分子（4）重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化－－－質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)－－－噬菌體（5）重組受體細(xì)胞的篩選與鑒定遺傳學(xué)方法：插入失活雙抗生素對(duì)照篩選免疫學(xué)方法：用抗血清轉(zhuǎn)化E.coli重組質(zhì)粒未轉(zhuǎn)化細(xì)胞原質(zhì)粒插入失活雙抗生素對(duì)照篩選重組質(zhì)粒培養(yǎng)基含Tet培養(yǎng)基含Tet+Amp培養(yǎng)基含Tet三、微生物與基因工程的關(guān)系1、基因資源2、基因工程的載體3、基因工程的工具酶4、基因克隆的宿主5、基因表達(dá)的生物反應(yīng)器6、基因工程理論研究基因組文庫(kù)用限制性內(nèi)切酶切割細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長(zhǎng)成克隆，文庫(kù)中每一克隆只含有特定的基因組DNA片段，含有該生物整套基因組DNA片段的所有克隆就叫做基因組文庫(kù).第二節(jié)，基因的分離、合成和定位誘變通過(guò)一系列酶催化作用，使總poly(A)mRNA轉(zhuǎn)變成dsDNA群體并插入到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，即構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)二、基因的化學(xué)合成1、目前已能合成150——200個(gè)核苷酸片段2、應(yīng)用：合成基因或基因元件合成核酸探針合成DNA引物

三、PCR擴(kuò)增基因

PCR－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一種體外快速擴(kuò)增靶DNA技術(shù)一，基本原理：與體內(nèi)DNA復(fù)制基本原理相似95℃變性dsDNAssDNA55℃退火引物與模板互補(bǔ)72℃延伸在引物3－OH加dNTP四、基因的定位誘變1、寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變PCR定位誘變第三節(jié)微生物與克隆載體一、質(zhì)粒載體