龍眼花后5代多胺類物質(zhì)的變化

多胺（pas）是一種低劑量的脂肪，含有生物活性，是植物體內(nèi)常見的低分子量。目前國內(nèi)外對多胺的研究多集中于腐胺(putrescence,Put)、亞精胺（sperdimine,Spd）、精胺（spermine,Spm）的生理作用。大量的研究結(jié)果已經(jīng)證實在果樹生長發(fā)育的重要時期均伴隨著多胺類的相應(yīng)變化，多胺對果樹的花芽分化、座果、果實生長發(fā)育、抗衰老、抗逆性以及根系形成等方面具有十分重要的生理功能。多胺參與果實生長發(fā)育進程的報道很多，在蘋果、梨、葡萄上的研究結(jié)果表明，多胺的含量在果實發(fā)育早期含量高，隨著發(fā)育進程逐漸降低；同時Escribano在柑桔和番荔枝上研究發(fā)現(xiàn)，多胺的含量在果實發(fā)育初期較高，隨著果實的的生長發(fā)育而降低，果實成熟期又升高。李建國等認為，多胺廣泛參與荔枝的座果以及果實生長發(fā)育的整個過程。但至今有關(guān)龍眼果實發(fā)育過程中內(nèi)源多胺的變化規(guī)律以及內(nèi)源多胺在果實發(fā)育中的作用未見報道。筆者以“石硤”龍眼為試材，追蹤果實發(fā)育過程中幼果、果皮、假種皮、種子中內(nèi)源多胺含量的變化動態(tài)，探討多胺在龍眼果實發(fā)育中的作用。1材料和方法1.1光皮爾最適樹種選擇在廣州市郊羅崗鎮(zhèn)西山農(nóng)場龍眼園選擇長勢良好，生長、物候期基本一致的龍眼5株為試材，供試品種為石硤龍眼（DimocarpuslonganLour.cv.Shixia），樹齡為7a。根據(jù)龍眼枝勢、枝粗分別在樹冠中上部東、西、南、北4個方向選取1個具有代表性的枝條，掛牌標記?；ê?d，座果后能判斷大小開始，在掛牌枝條上選取基準果2個，共40個果。中途如有脫落則參照正常果大小的平均值補足，直到果實發(fā)育成熟。1.2方法1.2.1取樣時間及次數(shù)從花后5d，即果實座果后開始采樣，參照標記的基準果，每隔10d取樣1次。采果后置冰壺帶回實驗室，用蒸餾水沖洗樣品2次，然后用紗布吸干果實表面水分，進行可溶性糖、蛋白質(zhì)及多胺的分析。1.2.2相對落果率的統(tǒng)計果實鮮、干重的變化：果實座果后，根據(jù)標記的基準果的大小，每株龍眼樹1次取果15～20個（前期果小取20個，后期果大取15個），用天平稱其鮮重，立刻放入烘箱在105℃下殺酶15min,60～70℃烘干至恒重，稱其干重，每隔10d取樣1次，直至果實采收。落果率的統(tǒng)計：果實座果后，分別統(tǒng)計標記果穗的存留果數(shù)，前2次每隔5d，以后每隔10d統(tǒng)計1次，追蹤其落果動態(tài)，直至果實采收時統(tǒng)計最終座果率。相對落果率（RAR）采用Zucconi的統(tǒng)計方法，公式如下：Xt和Xt-1分別為每個時期及上一時期的存留果數(shù)，d為2次統(tǒng)計之間相隔的天數(shù)。果實解剖與觀察：同時在以上樹上取果實5個，并對各部分組織進行解剖、觀察和記錄，手繪簡單的果實縱切解剖圖。1.2.3總糖的測定參照文獻，用3,5—二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測定可溶性總糖的含量（%）。1.2.4可可溶性物質(zhì)的測定1.2.5pas含量測定PAs的提取參照文獻的方法。分別稱取0.50g果皮、種子，1.00g果肉，用5mL預(yù)冷的5%(v:v）高氯酸（HClO4）在冰浴中研磨成勻漿，冰浴中浸提1h，低溫下（0～4℃）16000r/min離心20min，收集上清液用于PAs的測定。取PAs的上清液1mL，加入1.0mol/L的NaOH,10μL苯甲酰氯，旋渦振蕩20s后置室溫下保溫30min，然后加入2.0mL飽和NaCl,2.0mL冷乙醚，旋渦振蕩20s后在1500r/min下離心5min，收集1.0mL醚相于小試管中，用熱空氣吹干，剩余物置于-20℃下低溫冰箱保存?zhèn)溆谩As含量測定采用高效液相色譜法（HPLC），測定方法參照文獻的方法略加改進。Put,Spd,Spm標樣均購自Sigma公司。高效液相色譜儀為Agilent1100series，紫外檢測器為VWDG1314A，波長254nm，色譜柱為HypersilOSD反相柱（5μm,5.0mm×250mm），柱溫25℃，流動相為甲醇：乙腈：水=64:2.5:33.5(v:v），流速為0.5mL/min。待測樣品用200μL60%(v:v）甲醇溶解，用微孔濾膜（孔徑0.45μm）過濾后上機測定，進樣量為10μL，外標法定量計算，單位是nmol/g,FW。2結(jié)果與分析2.1龍眼果實的階段發(fā)育2.1.1花后7d種子基石硤龍眼果實發(fā)育如圖1所示。果皮首先增厚生長，花后45d左右增至最厚，平均厚度達1.53mm，隨后逐漸變薄。果實采收時，果皮厚度減至0.65mm。胚珠在謝花后即可見，花后5d種腔出現(xiàn)，但此時只是空腔；花后25d，種腔內(nèi)出現(xiàn)液態(tài)胚乳；花后45d，果蒂處出現(xiàn)小白點，以后不斷增大，花后45d，果肉（假種皮）僅形成薄薄的1層。同時，果實開始部分形成固態(tài)胚，種皮厚度增至最大?；ê?5d種皮開始由白色向黃色轉(zhuǎn)變，假種皮不斷增厚；花后75d種子接近飽滿，種皮完全變?yōu)楹稚４撕蠹俜N皮進入快速發(fā)育期，直至果實采收。2.1.2假種皮的制備石硤龍眼的單果鮮、干重呈現(xiàn)單“S”型曲線變化（見圖2）?；ê?～45d，即在液態(tài)胚乳向固態(tài)胚乳轉(zhuǎn)化，假種皮開始形成之前，果實鮮重緩慢增加，這段時間果實累積鮮重只占采收時果實鮮重的7.85%；花后55～95d，果實進入快速生長期，主要是假種皮的快速發(fā)育，果實鮮重占到采收時果實鮮重的82.71%。而干物質(zhì)的累積主要是在花后65～95d，占總干重的82.36%。2.1.3大量的生理落果從圖2可以看出，在果實生長發(fā)育全過程，石硤龍眼總體上存在3次相對大量的生理落果，分別是花后5～25d,65～75d和95d。其中以第1次生理落果最多，占總落果量的55.4%，而第2次和第3次生理落果顯著減少，分別占總落果量的7.53%,3.45%。2.2花后65d糖含量果實自花后45d開始出現(xiàn)薄薄的1層假種皮。由圖3可以看出花后45～65d假種皮中糖累積比較緩慢，花后65d糖含量為質(zhì)量分數(shù)9.98%，只占總糖的30.96%；花后65～95d糖累積持續(xù)加快，花后95d糖含量為19.13%；從花后95d開始，糖的累積趨于平緩，果實采收時糖含量為19.39%。可見67.13%可溶性糖是在花后65～95d這段時間積累的。2.3果皮可溶性蛋白質(zhì)含量的變化龍眼果實中的可溶性蛋白質(zhì)含量如圖4所示，在果實發(fā)育前期可溶性蛋白質(zhì)含量較高，達2.77mg/g,FW，花后5d開始下降，至花后15～35d為穩(wěn)定時期，35d后再次下降?；ê?5d開始，果皮中蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢，花后65d升至高點（1.83mg/g,FW）。此后，蛋白質(zhì)含量又急劇下降，直到果實采收?；ê?5d，假種皮出現(xiàn)薄薄的一層開始至花后85d，假種皮中可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)上升，花后85d達最高（1.44mg/g,FW），隨后又持續(xù)下降，直至果實采收。對于種子內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)變化，從圖中可以看出，種子內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的含量在花后45d相對較高（1.82mg/g,FW），以后呈現(xiàn)微弱的下降趨勢，花后75d以后變化平緩，直到果實采收。2.4龍眼果實發(fā)育過程中多胺含量的變化2.4.1微生物腐胺含量龍眼果實發(fā)育過程中腐胺的變化動態(tài)如圖5所示。龍眼果實發(fā)育初期，花后5d幼果中腐胺的含量最高（35.79nmol/g,FW），然后腐胺開始下降，至花后25d即第1次生理落果期降至最低（3.12nmol/g,FW）。伴隨著第1次生理落果的結(jié)束，果皮進入迅速發(fā)育期。果皮發(fā)育前期，腐胺含量較低；隨著果實的生長發(fā)育腐胺的含量不斷上升，花后55d腐胺達到高峰（38.72nmol/g,FW），此后果皮中腐胺含量不斷下降，果實采收前降至最低（4.57nmol/g,FW）。假種皮發(fā)育前期腐胺含量較高（105.15nmol/g,FW），然后持續(xù)下降，花后65d降到最低點（47.37nmol/g,FW）；花后75d腐胺隨著假種皮的迅速膨脹而開始回升，花后85d腐胺急劇上升，并且在果實采收時仍處于高水平?；ê?5～75d，種子內(nèi)腐胺含量變化相對平緩，75d后持續(xù)下降，花后95d腐胺含量降至最低（15.32nmol/g,FW）。比較幼果、果皮、假種皮、種子中的腐胺含量發(fā)現(xiàn)，假種皮中的腐胺含量最高，種子次之，果皮最低。2.4.2開始發(fā)育期亞精胺含量龍眼果實幼果期亞精胺含量的變化同腐胺的變化相似（如圖6），花后5d亞精胺的含量最高（45.74nmol/g,FW），然后急劇下降，花后35d降至最低點（7.47nmol/g,FW）。果皮開始發(fā)育時亞精胺的含量較高，花后55d出現(xiàn)一小高峰（28.55nmol/g,FW），隨后急劇下降，花后65d降至最低（2.93nmol/g,FW）；此后，亞精胺的含量一直處于較低的水平。假種皮開始發(fā)育時亞精胺含量即處在較高水平（20.15nmol/g,FW），隨著假種皮的發(fā)育而下降，花后75d降至最低（1.47nmol/g,FW）；此后，亞精胺開始回升，花后95d出現(xiàn)一高峰（15.64nmol/g,FW），果實成熟時又回落。種子發(fā)育前期亞精胺含量較低，花后65d開始升高，75d達到高峰（8.79nmol/g,FW），此后緩慢下降，直至果實成熟。2.4.3蘋果果酒精胺含量變化龍眼果實發(fā)育過程中精胺含量變化動態(tài)如圖7所示?；ê?d，龍眼幼果中精胺含量較低（5.32nmol/g,FW），隨著果實的生長發(fā)育而急劇上升，花后35d達到高峰（24.27nmol/g,FW）。果皮中，花后35d精胺開始下降，55d降至低點（3.68nmol/g,FW），隨后升高，65d達到11.73nmol/g,FW，隨后下降，花后85,95d精胺含量處于高水平，果實成熟前再次回落。假種皮發(fā)育初期，精胺含量較低（1.57nmol/g,FW），花后65d開始上升，并且一直持續(xù)到果實成熟（8.12nmol/g,FW）。種子發(fā)育初期，精胺含量較低（1.30nmol/g,FW），隨著種子的發(fā)育，精胺含量緩慢上升，花后65d驟然升高，至75d時升至26.64nmol/g,FW，隨之又下降，花后95d降至低點（4.68nmol/g,FW），果實成熟前又出現(xiàn)回升。3增加多胺含量，提高果實座果率筆者從謝花后5d開始測定果實的鮮、干重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實鮮、干重的變化呈典型的單“S”曲線（見圖2）。通過對龍眼果實的縱面解剖觀察（見圖1），結(jié)合葉玲等對龍眼果實發(fā)育階段的劃分，將石硤龍眼的果實發(fā)育分成2個時期：Ⅰ期，從謝花至花后45d，主要是果皮和種皮的發(fā)育，它們迅速增厚和增大，但胚和假種皮未發(fā)育。Ⅱ期，花后45d至果實成熟，主要是胚和假種皮的發(fā)育和生長，然后胚成熟，假種皮迅速增厚、增重。這樣劃分能客觀地反應(yīng)龍眼果實各組織的發(fā)育狀態(tài)和它們之間的相關(guān)性。本試驗龍眼果實發(fā)育早期，幼果、果皮、假種皮中的腐胺、亞精胺含量均較高，隨著果實的生長發(fā)育而急劇下降。這與Biasi等、Shiozaki等的研究結(jié)果一致。精胺含量在果實發(fā)育初始階段較低，果實迅速膨大階段急劇上升（見圖5～7）。由此可見，果實發(fā)育前期，高含量的腐胺、亞精胺與果實胚、胚乳、果皮以及假種皮激烈的細胞分裂活動吻合，這說明，高含量的腐胺、亞精胺有利于果實發(fā)育。精胺在果實發(fā)育初期含量低，果實膨大期含量急劇上升，這說明精胺可能與果實膨大之間的關(guān)系更緊密。果實成熟時，各部分組織中的多胺含量又有所回升，這可能與多胺延緩衰老有關(guān)。王漢忠等認為，多胺促進細胞分裂，主要是多胺通過促進DNA旋轉(zhuǎn)酶、RNA聚合酶等的活性，從而有利于DNA,RNA以及蛋白質(zhì)的合成。在龍眼果實發(fā)育前期，多胺和蛋白質(zhì)含量（見圖4）均較高，而果實在這段時間主要進行細胞分裂。在荔枝上的研究也揭示了多胺含量變化與DNA和蛋白質(zhì)含量變化有相應(yīng)的關(guān)系，也說明多胺含量的增加與核酸和蛋白質(zhì)合成是基本一致的。Biasi等報道，蘋果內(nèi)的自由態(tài)多胺含量水平與果實的生長速率變化動態(tài)一致。幼果的第1次細胞膨大期間，多胺處于較高的含量水平，并且發(fā)現(xiàn)多胺高峰出現(xiàn)在果實生長高峰之前。本試驗結(jié)果表明，在龍眼果實的迅速膨大期，假種皮內(nèi)游離的腐胺、亞精胺、精胺含量迅速上升，并處在較高的水平（見圖5～7）。果實生長進入迅速膨大期，假種皮中總糖、蛋白質(zhì)（見圖3,4）含量也迅速增加。另外，多胺、蛋白質(zhì)含量快速上升同樣出現(xiàn)在果皮和種子的快速生長階段。本試驗的結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，這說明多胺不僅促進果實細胞分裂，而且也對果實的膨大起作用。果實脫落發(fā)生在果實內(nèi)多胺水平較低的時候。本試驗龍眼果實的腐胺、亞精胺在座果初期時含量最高，隨后急劇下降，生理落果結(jié)束后出現(xiàn)回升（見圖5,6），這與前人的研究結(jié)果一致。早期的研究結(jié)果表明，多胺提高果實座果率原因可能是多胺提高蘋果花粉活力，促進花粉管伸長，延長了胚珠的生命力周期。鐘曉紅報道，在沙田柚開花過程中，花藥中3種多胺含量逐漸降低；從蕾期到第1次生理落果，幼果內(nèi)的多胺呈下降趨勢，但受精幼果比未受精幼果下降速度緩慢；用3種多胺噴布花蕾，均促進花粉管伸長，延緩胚珠衰老，增強受精能力，提高座果率。盛花后2周噴施外源多胺提高座果率，與噴施多胺后改變幼果內(nèi)的生理生化代謝有密切關(guān)系。Singh等認為這種生理生化代謝主要是多胺抑制了乙烯的生物合成。因為多胺是乙烯的生成抑制劑，它降低了ACC的合成酶活性。徐繼忠等從另一個角度揭示了多胺