型蛋白質構造分析手段-氫氘交換質譜技術進展氫氘交換質譜法是一種爭論蛋白質空間構象的質譜技術。它在蛋白質構造及動態(tài)變化爭論、蛋白質相互作用位點覺察、蛋白表位及活性位點鑒定方面有著廣泛的應用。隨著氫氘交換質譜技術的不斷進展，它正在成為構造生物學家及生物藥物研發(fā)的重要手段。氫氘交換質譜是一種爭論蛋白質空間構象的質譜技術。其原理是將蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氫原子將于重水的氘原子發(fā)生交換，而且蛋白質外表與重水親熱接觸的氫比位于蛋白質內部的或參與氫鍵形成的氫的交換速率快，進而通過質譜檢測確定蛋白質不同序列片段的氫氘交換速率，從而得出蛋白質空間構造信息[1]入水中，然后提出水面并張開手掌。這時，潮濕的手背說明它在“拳頭”的構造中處于外外表，而較為枯燥的手心說明它是“拳頭”的內部。除樣品制備外，氫氘交換質譜法的主要過程包括：交換反響、終止反響、將蛋白快速酶切為多肽、液相分別、質譜檢測、數據解析。其中交換步驟需要在多個反0s、10s、1min、10min、60min等，以繪制交換率曲線，得到準確全面的信息。氫氘交換質譜技術在蛋白質構造及其動態(tài)變化爭論[1][2]、蛋白表位及活性位點鑒定方面有著廣泛的應用[3]。X射線晶體衍射和核磁共振等方法，氫氘交換質譜不能夠供給準確的蛋白空間構造，它直接供給的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋-蛋白相互作用位點等。但是氫氘交換質譜技術有著其他經典方法不具備的優(yōu)點：首先，可以進展蛋白質構造動態(tài)變化的爭論是氫氘交換質譜的一個突出優(yōu)點，包括變化中的活性位點及表位；其次，氫氘交換質譜在蛋白復合體構象的爭論中也具有獨到的優(yōu)勢；此外，氫氘交換質譜還具有對樣品需求量小、純度要求相對較低、爭論對象為溶液環(huán)境下的蛋白質的自然構象而非晶體中構象等優(yōu)勢[1,4,5]1991年第一篇爭論論文發(fā)表起，氫氘交換質譜技術不斷進展，已經成為構造生物學及質譜技術中一個格外重要的應用領域[6]質譜試驗的簡單的實現過程在肯定程度上影響了其應用的廣泛度。主要的難點有：1、如何避開交換后氘代肽段的回交現象；2、試驗掌握的高準確性和重現性要求；3、交換后造成的疊加的質譜峰如何準確區(qū)分；4、簡易高效的分析軟件需求；5、以氨基酸為單位的交換位點辨析。沃特世公司xx年起，針對以上難點不斷進展攻關，推出了目前唯一--nanoACQUITYUPLC?HD-ExchangeSystem(圖1)范圍內，這套系統(tǒng)已經幫助科學家在包括Cell、Nature等頂級爭論期刊中發(fā)表爭論論文[7,8]。除科研需求外，沃特世氫氘交換質譜系統(tǒng)也受到眾多國際領先制藥公司的認可，并用于藥開發(fā)中蛋白藥物活性位點及表位的爭論工作中。氫氘交換試驗中的回交現象將嚴峻影響試驗數據的可信度甚至導致錯誤結果的產生要避開回交需要做到兩點：盡量縮短液質分析時間和保證液質分析中的溫度和pH為最低回交反響系數所要求的環(huán)境沃特世UPLC?系統(tǒng)承受亞二納米色譜顆粒填料，較HPLC使用的大顆粒填料，UPLC具有無與倫比的分別度。因此UPLC可以做到在不損失色譜分別效果的要求下，極大縮短液相分析時間的要求[9]。對于對溫度和pH 控制問題，在多年的工程學改進中，nanoACQUITYUPLCHD-ExchangeSystem 已經實現了對酶切、液相分別等步驟的全程掌握[10]。對氫氘交換質譜試驗準確性和重現性的要求是其應用的其次個主要難點。在試驗中一般需要采集0s、10s、1min、10min60min240min10S-10min等幾個時間點的準確操作。再考慮到重復試驗的需求，人工手動操作會對最終數據可信度產生影響。而且試驗過程重復繁瑣，將給試驗人員帶來格外大的工作壓力。nanoACQUITYUPLCHD-ExchangeSystem完全通過智能機械臂，準確完成交換、終止交換、進樣、酶切等一系列試驗過程，而且始終保證各個步驟所需不同的溫度環(huán)境。這些自動化過程不但保證了試驗數據的牢靠性，提高了試驗效率，也將科學家從繁瑣的重復試驗中解放出來。氫氘交換試驗的質譜數據中，隨著交換時間的延長，發(fā)生了交換反響的多肽，由于質量變大，其質譜信號將漸漸向高質荷比方向移動。因此，這些質譜峰可能與哪些未發(fā)生交換反響的多肽質譜峰漸漸疊加、相互掩蓋。相互疊加的質譜信號，不但影響對峰歸屬的推斷，更會增加交換率數據的誤差。由于交換率推斷需要通過對發(fā)生交換的多肽進展定量，毫無疑問因疊加的而混亂的質譜數據將極大的影響對質譜峰的準確定量。這點對于單純通過質荷比進展分析的質譜儀來說完全無能為力。但是，這個看似不行能完成的任務卻被沃特世nanoACQUITYUPLCHD-ExchangeSystem攻克了這是由于，不同于其它常見質譜，沃特世的SYNAPT?質譜平臺還具備依據離子大小及形態(tài)進展分別的功能。在數據處理時，除多肽離子的質荷比信息外，還可以通過離子遷移時間將不同離子區(qū)分。因此這種SYNPAT獨有的被命名為HDMSE的質譜分析技術可以將因質荷比一樣而重疊的多肽分別開，輕而易舉地解決了質譜信號疊加的問題，得到準確的交換率數據[11,12]。SYNPAT質譜平臺一經推出就奪得了xx 年PITTCON 金獎，目前已經推出了一代的SYNAPTG2HDMS、SYNAPTG2-SHDMS等型號，并具備ESI、MALDI等多種離子源。除氫氘交換技術外，SYNAPT質譜系統(tǒng)在蛋白質復合體構造爭論中也是獨具特色，已有多篇高質量應用文獻發(fā)表[13,14,15]。實現氫氘交換質譜技術的第四個關鍵點，是如何高效分析試驗產生的多時間點及屢次重復帶來的大量數據。人工完成如此巨大的信息處理工作，將消耗科學家大量的時間。沃特世氫氘交換質譜解決方案所供給的DynamX軟件可以為科學家供給簡便直觀的分析結果，并包含多種呈現方式。在某些特別爭論中，要求對蛋白氫氘交換位點做到準確到氨基酸的測量，這是氫氘交換質譜爭論的又一個難點。在常規(guī)的爭論中承受CID重排，而致使不能對發(fā)生交換的具體氨基酸進展準確定位。SYNPATETD碎裂模式可以避開氘原子重排造成的信息混亂，并具有良好的碎裂信號[16]。沃特世的nanoACQUITYUP