神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白與突觸可免性

相關(guān)的神經(jīng)生長(zhǎng)蛋白（dap-43）和相關(guān)的神經(jīng)誘生素（cdam）與軸突生長(zhǎng)密切相關(guān)，對(duì)觸覺可塑性影響重要。GAP-43是脊椎動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞膜上一種特異性磷蛋白,在腦中分布廣泛但不均一,在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷再生等事件中,常能監(jiān)測(cè)到GAP-43在mRNA和蛋白水平上的明顯升高,國(guó)際上將GAP-43列為研究神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)等神經(jīng)可塑性的首選分子探針。NCAM神經(jīng)細(xì)胞黏附因子是細(xì)胞表面糖蛋白大家族的成員之一,對(duì)長(zhǎng)時(shí)記憶的保持有重要影響,其功能的實(shí)施需GAP-43的調(diào)節(jié)作用。二者與突觸可塑性密切相關(guān),綜述如下。1海膽排酸酶基因中的小體結(jié)構(gòu)及神經(jīng)纖維網(wǎng)高表達(dá)1.1GAP-43的結(jié)構(gòu)及生化特性含有226~243個(gè)氨基酸,只一個(gè)芳香族氨基酸殘基而Ala、Glu、Lys和Pro的含量極豐富。其分子質(zhì)量為24ku,等電點(diǎn)4.3~4.5。GAP-43在脊椎動(dòng)物非神經(jīng)組織很少表達(dá),所以被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白。根據(jù)克隆到的大鼠、小鼠、牛以及人等的cDNA序列,不同物種GAP-43一級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度的同源性,活性位點(diǎn)基本一致,氨基末端的短水解區(qū)是與膜結(jié)合位點(diǎn),第41位絲氨酸是PKC催化的磷酸化作用活性位點(diǎn),第43~51位氨基酸構(gòu)成與鈣調(diào)素的結(jié)合位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主,整個(gè)分子呈棒狀,具有很強(qiáng)的柔性。編碼GAP-43蛋白的基因位于人的3染色體(HSA3),在小鼠中位于16染色體,人和大鼠的GAP-43基因均為單拷貝,包括2個(gè)啟動(dòng)子和3個(gè)外顯子,第1個(gè)外顯子編碼第1~10氨基酸,包括蛋白的膜結(jié)合域和G0、Giα1活性域。第2個(gè)外顯子編碼蛋白的大部分,包括CaM的結(jié)合點(diǎn)以及PKC磷酸化位點(diǎn)。第3個(gè)外顯子編碼蛋白的羧基末端,其中包括一個(gè)F-motif,猜測(cè)它可能與細(xì)胞骨架成分相互作用。GAP-43具有高親水性并可能通過與膜脂肪酸共價(jià)連接而與神經(jīng)元膜結(jié)合,它在突觸前膜和生長(zhǎng)錐的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)中含量極高,胞漿中含量極低,這符合人們對(duì)其構(gòu)型的一設(shè)想模式,即:GAP-43從生長(zhǎng)錐或突觸膜表面伸展開來,一方面與胞質(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白相互作用,另一方面,它可逆的附著在膜表面。1.2GAP-43與突觸可塑性大體有兩種類型突觸可塑性變化與GAP-43的表達(dá)相關(guān),首先突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化可導(dǎo)致GAP-43表達(dá)的升高,如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)的分化,軸突再生以及神經(jīng)受損后的修復(fù)。其次,由LTP和LTD所引發(fā)的突觸效能的變化,可影響GAP-43的磷酸化狀態(tài)和mRNA的表達(dá)。曾有研究發(fā)現(xiàn),GAP-43不存在于神經(jīng)干細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞中,只存在于已分化定型并開始軸突生長(zhǎng)的神經(jīng)元中,并且不依賴于神經(jīng)元的胚胎起源,這提示GAP-43在新生神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)、發(fā)育中起作用。大鼠GAP-43在神經(jīng)纖維網(wǎng)高表達(dá)的時(shí)期與軸突的延伸生長(zhǎng)、突觸形成的起始密切同步,大鼠腦發(fā)生區(qū)神經(jīng)元未延徙和最終分裂之前,幾乎無GAP-43及其mRNA的表達(dá),即使神經(jīng)元完成了有絲分裂,在其突起長(zhǎng)出之前,也很少見其中有GAP-43表達(dá)。分化一旦開始,胞體和初生突起中便可見大量的GAP-43,這明顯顯示出GAP-43與神經(jīng)發(fā)育密切的關(guān)系。另外,與GAP-43磷酸化的變化密切相關(guān)的生理現(xiàn)象之一便是突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)即LTP。在海馬CA1區(qū)高頻刺激誘導(dǎo)出LTP(這其中需要NMDA受體的激活),之后,對(duì)GAP-43磷酸化程度進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),大鼠海馬腦片CA1區(qū)僵直刺激后10~60min可導(dǎo)致GAP-43磷酸化的提高,至120min后不再增長(zhǎng),用NMDA受體阻斷劑AP5抑制LTP后,GAP-43磷酸化的提高也受到抑制,如僵直刺激沒有誘導(dǎo)出LTP,則GAP-43磷酸化程度也沒有呈現(xiàn)出相應(yīng)的提高。這說明GAP-43磷酸化程度與LTP的表達(dá)正相關(guān),而非僵直刺激所致。而且海馬腦片中GAP-43磷酸化升高的幅度與興奮性突觸后電位(EPSP)的斜率,在僵直刺激60min內(nèi)呈現(xiàn)出相關(guān)性提高。GAP-43磷酸化的提高依賴突觸后NMDA受體的激活,以及逆行性信使的作用,如花生四烯酸(AA)和NO,但其在LTP過程中刺激GAP-43磷酸化的特別角色尚待深入研究。1.3GAP-43的一個(gè)作用模型是特異性存在于神經(jīng)系統(tǒng)中的參與細(xì)胞形態(tài)和連接的調(diào)節(jié)蛋白,許多由GAP-43所參與的過程看起來并不相關(guān),從生長(zhǎng)錐形態(tài)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化到其與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合,以及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié),而且LTP誘導(dǎo)后GAP-43磷酸化水平提高。所有GAP-43這些功能體現(xiàn),一方面可能它們互相獨(dú)立,表現(xiàn)出GAP-43的多功能性,另一方面也可能是GAP-43的單方面功能在多個(gè)過程中的體現(xiàn)。由此演繹出GAP-43對(duì)于軸突的長(zhǎng)出和突觸可塑性的作用的綜合表達(dá)模型(見圖1)。(1)GAP-43作為一個(gè)位于生長(zhǎng)錐和突觸前末端中的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,與質(zhì)膜相連。當(dāng)鈣通道打開以及鈣離子在受體激活后由細(xì)胞內(nèi)庫(kù)釋放,生長(zhǎng)錐或突觸前末端的鈣離子濃度提高,CaM從GAP-43釋放。(2)鈣調(diào)蛋白從GAP-43釋放可能觸發(fā)PKC對(duì)GAP-43的磷酸化。蕈毒堿受體和/或代謝性谷氨酸受體的激活對(duì)GAP-43磷酸化具調(diào)節(jié)作用。(3)PIP2在磷脂酶C(PLC)催化下可水解產(chǎn)生甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3),后者可作為鈣離子釋放信號(hào)。PKC磷酸化GAP-43可抑制生長(zhǎng)錐和成年腦中的磷脂酰肌醇(PIP)激酶活性、減少PIP2的形成,這對(duì)于受體介導(dǎo)的GAP-43磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)提供了一個(gè)負(fù)反饋。同時(shí),PIP2通過影響肌動(dòng)蛋白的聚合作用和G蛋白的激活介入軸突生長(zhǎng),而且,PIP2看起來在突觸小泡溶和中起關(guān)鍵性的作用。(4)從GAP-43釋放的CaM刺激了F-肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的聚合作用,這可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架的修飾,對(duì)于GAP-43所促進(jìn)的膜擴(kuò)展延伸過程具重要意義。而這些CaM介導(dǎo)的細(xì)胞骨架構(gòu)筑的變化可能是GAP-43所導(dǎo)致的許多系統(tǒng)形態(tài)變化的主要原因之一。(5)細(xì)胞骨架和亞膜骨架蛋白包括F-肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、CaM結(jié)合蛋白,它們?cè)谏L(zhǎng)錐功能以及胞飲/胞吐中扮演重要角色。GAP-43是與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合的蛋白之一,如上所述,GAP-43與CaM的動(dòng)力學(xué)結(jié)合/離解過程在細(xì)胞骨架的重組中扮演重要角色,尚不知是否此結(jié)合對(duì)GAP-43與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合有所影響。(6)從GAP-43釋放的CaM可作為不同酶的激活劑,如c-AMP磷酸酯酶,CaM-依賴性蛋白激酶和CaN等,它可激活參與軸突生長(zhǎng)和胞飲/胞吐膜再循環(huán)的過程,其中后者參與了小泡溶和、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。AB-50localizationinthegrowthcone/axonandthepresynapticterminal.BUnifyinghypothesisshowingtheinvolvementofB-50inprocessescommontothegrowthconeandthepresynapticterminal.(7)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增加會(huì)伴隨GAP-43磷酸化的提高,成年大鼠海馬腦片和皮層突觸小體中GAP-43磷酸化的提高與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增加相關(guān)。反之,GAP-43磷酸化程度也可局部調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放量以及CaM的作用。(8)Ca2+以及CaM水平的提高可激活CaN,它可使GAP-43及dynaminⅠ去磷酸化,dynaminⅠ對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)小泡的泡飲很重要。(9)Ca2+濃度的提高刺激Ca2+依賴性蛋白酶,如calpain,使GAP-43水解?？傊?生長(zhǎng)錐的形態(tài)學(xué)和軸突的長(zhǎng)出看起來主要被GAP-43的表達(dá)水平調(diào)節(jié),GAP-43的獨(dú)特性質(zhì)在于它是突觸前末端的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白,與膜聯(lián)合,與CaM結(jié)合,GAP-43不直接參與膜骨架蛋白的聚合作用,但可釋放CaM,CaM刺激肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的聚合作用,而且GAP-43參與了膜的擴(kuò)展、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,作用于胞吞/胞吐過程,通過小囊溶和或誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐和突觸前末端的胞吞促進(jìn)膜擴(kuò)展。GAP-43作用過程中,PIP2、CaM以及G蛋白、細(xì)胞骨架蛋白貫穿其中,構(gòu)成GAP-43的緊密級(jí)聯(lián)作用體系。2接觸彈性和rcm2.1ncams的結(jié)構(gòu)NCAM是細(xì)胞表面糖蛋白大家族的成員之一,由一個(gè)含有26個(gè)外顯子的單拷貝基因進(jìn)行選擇性拼接,產(chǎn)生出至少20~30個(gè)同位體。NCAM基因中vase外顯子,可通過選擇性拼接插入到NCAM的不同位置并因此表現(xiàn)出不同的功能:插入到NCAM分子中調(diào)節(jié)同源親和性結(jié)合的決定簇附近,可調(diào)節(jié)NCAM分子之間的識(shí)別;插入到NCAM中類似免疫球蛋白分子的高變區(qū),可參與一些新的相互作用,它與NCAM的-CH2殘基的連接位點(diǎn)非常鄰近,可改變后者的構(gòu)型、定向及其連接特性。NCAMs為一組多肽鏈,含有與免疫球蛋白和纖連蛋白決定簇相關(guān)的結(jié)構(gòu)。每條鏈都有5個(gè)連續(xù)的同源區(qū),區(qū)內(nèi)有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵,5區(qū)之后為類似于纖維黏連蛋白Ⅲ重復(fù)系列的重復(fù)區(qū)。不同肽鏈的差別既表現(xiàn)在胞漿區(qū)的不同,也表現(xiàn)在與細(xì)胞膜連接的方式不同。如雞NCAMs的3個(gè)多肽,其胞外區(qū)相同,是跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)不同,兩個(gè)較大的多肽以胞漿段整合到膜蛋白,其中較大者(ld)在胞漿區(qū)有261個(gè)氨基酸,較小的多肽(sd)則沒有,最小的多肽(ssd)無跨膜區(qū),無胞漿區(qū)。ld和sd整合到膜上,能運(yùn)動(dòng),可被脂肪酸?；?ssd無跨膜區(qū),但錨在磷脂上,更易于在膜表面運(yùn)動(dòng)。sd和ld胞漿區(qū)可與細(xì)胞的有關(guān)分子相互作用,發(fā)生絲、蘇氨酸的磷酸化,其中l(wèi)d含有更多的磷酸化位點(diǎn)。NCAMs的三維結(jié)構(gòu)電鏡分析表明:其分子末端有一段鉸鏈結(jié)構(gòu),有助于在細(xì)胞形態(tài)改變時(shí)易化跨膜的同種親和。2.2ncam對(duì)突變塑性的作用有幾方面的試驗(yàn)事實(shí)支持NCAMs在突觸可塑性和記憶中的作用:①在某些持續(xù)性突觸發(fā)生和可塑性的腦區(qū)有與軸突在發(fā)育階段生長(zhǎng)類似的特征性NCAM表達(dá)。②在突觸可塑性和學(xué)習(xí)中可監(jiān)測(cè)到NCAM表達(dá)或翻譯后修飾。③特異的針對(duì)NCAN或相應(yīng)合成多肽的抗體可阻止LTP的產(chǎn)生(當(dāng)LTP已形成時(shí),其維持不受此類抗體影響)。④NCAM基因缺損小鼠,具學(xué)習(xí)記憶及行為障礙,形態(tài)學(xué)研究顯示,其海馬苔蘚纖維異變,海馬腦片電生理研究也顯示出與對(duì)照組相比呈現(xiàn)明顯突觸傳遞抑制。NCAM參與突觸可塑性有兩個(gè)機(jī)制:①NCAM介導(dǎo)的細(xì)胞骨架動(dòng)力的改變,涉及活動(dòng)依賴性突觸重建。N-粘著蛋白的胞漿區(qū)直接與細(xì)胞骨架作用,而NCAM、L1的胞漿區(qū)直接與ankyrins(位于特異胞膜區(qū)的胞漿表面的spectrin結(jié)合蛋白家族的一員)相連。②為胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)。其具如下特點(diǎn):胞內(nèi)信號(hào)改變可反饋到突觸后膜,通過NCAM調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞的黏附,迅速改變突觸的結(jié)構(gòu)和效能。胞內(nèi)蛋白水解酶calpain水解NCAM的胞內(nèi)區(qū),可較快地解除和重新組織突觸的結(jié)構(gòu)聯(lián)系。使用相應(yīng)的可溶性NCAM的抗體作用于神經(jīng)元可觸發(fā)許多第二信使水平的改變,繼而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致突觸效能的改變。試驗(yàn)中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體抗體抑制NCAM所介導(dǎo)的軸突生長(zhǎng),FGF受體的激活可增大NCAM的刺激作用。另外,花生四烯酸(AA)在NCAM刺激的軸突生長(zhǎng)過程中起核心作用,且促進(jìn)PKC對(duì)作用底物GAP-43的磷酸化,PLC及D