放射毛霉蛋白酶sp1基因的克隆與分析

優(yōu)雅輻射是我國傳統(tǒng)食品豆腐乳和豆類的主要生產(chǎn)細(xì)菌之一。這種酶對豆類蛋白質(zhì)的水解作用非常有效。水解產(chǎn)品具有廣泛的生理活性和較低的苦味。因此，優(yōu)雅輻射酶對促進(jìn)和消除食物和睡眠對人類疾病的水分作用具有一定的應(yīng)用潛力。雖然這種酶對豆類蛋白的水分作用非常好，但優(yōu)雅輻射綠桃的酶含量非常少，這使得該產(chǎn)品在工業(yè)中的應(yīng)用變得困難。目前，一些科學(xué)家正在研究優(yōu)雅輻射綠桃的生酶發(fā)酵特性，以及酶對植物蛋白素的水解作用。檢測酶蛋白序列和酶結(jié)構(gòu)。文中對雅致放射毛霉絲氨酸蛋白酶(SP1)基因的cDNA和DNA分別進(jìn)行了克隆和測序,運(yùn)用生物信息學(xué)的理論和方法對該酶的基因結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了較為全面的分析,以期為該酶基因的克隆表達(dá)及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究提供參考.1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1蘑菇雅致放射毛霉為華南理工大學(xué)廣東省酶與發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株.1.1.2pcr和dnaTrizol試劑和各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增引物購自Invitrogen(廣州)公司;BDBiosciencesClontechSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit和PCR試劑購自TaKaRa(大連)公司;FungalDNAKit購自O(shè)megaBio-Tech(廣州)公司;其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純.1.2測試方法1.2.1固體培養(yǎng)基分組將雅致放射毛霉接種在裝有麩皮固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,25.0℃恒溫培養(yǎng)48h.該固體培養(yǎng)基組分為:96.41%麩皮,0.23%麥芽糖,1.56%蛋白胨,0.74%KH2PO4,0.06%FeSO4·7H2O,起始含水量為每克麩皮1.00mL水.1.2.2rna和dna的提取收集雅致放射毛霉菌絲體,用液氮研磨至粉末,按照Trizol試劑盒和FungalDNAKit的指導(dǎo)手冊提取鑒定RNA和DNA,于-70℃保存?zhèn)溆?1.2.3合成pta利用TaKaRa(大連)公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,根據(jù)其指導(dǎo)手冊反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.1.2.4glpa及gtsmat-p保守序列的檢測采用Bio-Edit7.0軟件中的ClusterWMultipleAlignment程序?qū)enBank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的Ajellomycesdermatitidis、Penicilliumchrysogenum和Aspergillusflavus等霉菌的絲氨酸蛋白酶序列進(jìn)行比對,得到GHGTHC和GTSMAT(S)P保守序列;根據(jù)該保守序列設(shè)計(jì)簡并引物S1(5′GGYCAYGGHACYCAYTGT3′)和A1(5′GGRGWRGCCATRGARGTA-CC3′).然后以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收,克隆載體至pMD18-T上后,經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽性克隆,測序.1.2.5westernblot檢測race基因,按照SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit中3′RACE和5′RACE的指導(dǎo)手冊,分別克隆獲得蛋白酶基因的3′和5′端序列.3′RACE引物為3′GSP(5′CCACGACAGAACACGTCAAGGAAGC3′)和3′NGSP(5′GAACGGGCTTACTTTTCAAACTACG3′);5′RACE引物為5′GSP(5′TTACCAGCGGCAACGGCAAAGAC3′)和5′NGSP(5′GAGGCTTCCTTGACGTGTTCTGT3′).1.2.6pcr擴(kuò)增條件利用DNAMAN5.0軟件拼接中間片段序列、3′和5′端序列獲得全長基因序列,根據(jù)全長基因序列設(shè)計(jì)引物S2(5′CTTTTAAATAAACACCATGAAGC3′)和A2(5′ATGGTATTTGCAAATCCAAAGAGT3′),再分別以cDNA和DNA為模板進(jìn)行PCR,對PCR產(chǎn)物測序,提交測序結(jié)果至GenBank數(shù)據(jù)庫.1.2.7生物信息數(shù)據(jù)庫和通用分析軟件2結(jié)果與分析2.1pcr擴(kuò)增結(jié)果利用引物S2/A2,以cDNA和DNA為模板均擴(kuò)增獲得同預(yù)期大小一致的單一PCR產(chǎn)物(見圖1),測序結(jié)果提交GenBank獲得登錄號為GU356536.2.2a.條件二:開放閱讀框運(yùn)用Bio-Edit7.0軟件中的ClustalWMultipleAlignment程序?qū)P1基因的DNA序列和mRNA序列進(jìn)行比對分析(見圖2),結(jié)果表明該基因編碼區(qū)長1533bp,由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,定義開放閱讀框的起始位點(diǎn)A堿基編號為1,內(nèi)含子分別位于360-412(53bp)、758-814(57bp)和1049-1106(58bp),外顯子分別位于1-359(359bp)、413-757(345bp)、815-1048(234bp)和1107-1533(427bp).對其密碼子使用偏好性分析可知,密碼子末位的T堿基使用頻率較高(44%),G堿基使用頻率較低(14%).2.3堿性氨基酸ld50SP1由454個(gè)氨基酸殘基組成,Ala含量最高,為48個(gè)(10.57%,摩爾分?jǐn)?shù),余同),Cys含量最低,為3個(gè)氨基酸(0.66%);非極性氨基酸(A、V、L、I、F、W、M和P)為184個(gè)(40.52%),極性氨基酸(G、S、T、C、Y、N和Q)為153個(gè)(33.70%),非極性氨基酸含量高于極性氨基酸;堿性氨基酸為59個(gè)(12.99%);酸性氨基酸為58個(gè)(12.78%).SP1氨基酸殘基序列的功能組成分別是:1-18為信號肽,19-131為前導(dǎo)肽,132-454為成熟肽(見圖2).成熟肽的相對分子質(zhì)量為344559,理論等電點(diǎn)為6.52.細(xì)胞定位分析表明,成熟SP1是一種分泌型的胞外酶.絲氨酸蛋白酶類Subtilase家族含有[STAIV]-{ERDL}-[LIVMF]-[LIVM]-D-[DSTA]-G-[LIVMFC]-x(2,3)-[DNH]、H-G-[STM]-x-[VIC]-[STA-GC]-[GS]-x-[LIVMA]-[STAGCLV]-[SAGM]和G-T-S-x-[SA]-x-P-x-{L}-[STAVC]-[AG]3個(gè)高度保守的Motif.這3個(gè)Motif分別位于SP1的171-182、207-217和370-380位點(diǎn),這說明該SP1屬于絲氨酸蛋白酶類的Subtilase超家族.Subtilase超家族由6個(gè)家族的蛋白酶構(gòu)成,SP1屬于該6個(gè)家族中的蛋白酶K家族.2.4生長孢囊梗的菌株以SP1氨基酸序列作為對照序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫中找出同源性較高的霉菌絲氨酸蛋白酶序列,運(yùn)用MEGA5.0軟件中的ClustalW程序進(jìn)行序列比對,然后利用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖3).由圖3可見,11株霉菌歸為2大類,屬于子囊菌亞門和半知亞門的Talaromycesstipitatus、Botryotiniafuckeliana和Chaetomiumthermophilum等8個(gè)菌株歸為第1類;屬于接合菌亞門毛霉科的A.elegans、Mucorracemosus和Rhizopusmicrosporesvar.chinensis3個(gè)菌株歸為第2類.對菌絲體生長孢囊梗的方式分析可知,A.elegans和R.microsporusvar.chinensis是從匍匐菌絲上長出孢囊梗;而M.racemosus不是從匍匐菌絲上長出孢囊梗,該結(jié)果表明R.microsporusvar.chinensis和A.elegans菌絲體生長孢囊梗的方式比較相似,親緣關(guān)系可能相對較近,同圖3的進(jìn)化樹結(jié)果一致.這表明以蛋白酶氨基酸殘基序列構(gòu)建進(jìn)化樹對微生物之間的進(jìn)化親緣關(guān)系具有重要的參考價(jià)值.2.5蛋白酶k和sp1的序列比對SP1與E.album的蛋白酶K(PDBcode:1IC6)的序列相似度為44.41%,這表明能以1IC6作為模板對SP1進(jìn)行同源建模,模擬的SP1結(jié)構(gòu)模型見圖4.進(jìn)一步對該模型主鏈的φ和ψ角進(jìn)行Rama-chandran分析,結(jié)果表明φ和ψ角均在允許范圍,這表明構(gòu)建的SP1結(jié)構(gòu)合理.蛋白酶K與SP1的序列比對結(jié)果見圖5.由圖4和5可知,這兩個(gè)酶都是由15個(gè)β折疊、6個(gè)α螺旋和2個(gè)3/10的α螺旋的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成.催化三聯(lián)體Asp44\His76\Ser241(以SP1氨基酸殘基的序號進(jìn)行編號,下同)分別位于第3個(gè)β折疊、第3個(gè)α螺旋和第7個(gè)α螺旋上;這3個(gè)殘基在一級結(jié)構(gòu)上距離較遠(yuǎn),而在空間結(jié)構(gòu)上較近.雖然兩種酶空間結(jié)構(gòu)整體相似,但是其二級結(jié)構(gòu)間也存在部分差異:(1)SP1的β1、β2、β12、β13、α4、α7和α8均比蛋白酶K相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)序列短,只有SP1的β4比蛋白酶K長;(2)SP1的二級結(jié)構(gòu)α1-β2、β4-α3、α4-β6、β12-β13和α7-α8之間比蛋白酶K相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)間插入了更多的氨基酸殘基,并且SP1的N末端比蛋白酶K長;(3)構(gòu)成兩種酶轉(zhuǎn)角或者loop環(huán)的氨基酸殘基之間存在部分差異.因此,由于氨基酸殘基的替換、刪除、取代或者插入使得SP1結(jié)構(gòu)不同于蛋白酶K結(jié)構(gòu),這可能是導(dǎo)致其水解性質(zhì)不同的原因之一.2.6sp1和其2的酶催化反應(yīng)酶的耐堿性越強(qiáng),其溶劑可及表面積比值R/(R+K)(R和K分別為精氨酸殘基和賴氨酸殘基的溶劑可及表面積)越高,如M-proteases、AprB和SubtilisinBPN′的殘基比值分別為0.62、0.57和0.17,3種酶的最適反應(yīng)pH值分別為12.3、10.0和9.0.SP1的R/(R+K)為0.48,這表明SP1的耐堿性可能較強(qiáng).對于SP1和蛋白酶K的催化三聯(lián)體Asp/His/Ser而言,Asp殘基大部分包埋在酶中,只有少許側(cè)鏈基團(tuán)暴露在酶表面,His側(cè)鏈均明顯地暴露在酶表面;但SP1具有親核功能的Ser殘基側(cè)鏈的溶劑可及表面積0.033093nm高于1IC6的0.014756nm,表明其側(cè)鏈更多地暴露在酶表面(見圖6),這可能致使SP1的Ser殘基更容易對底物進(jìn)行親核攻擊,提高催化效率.2.7sp1和s13殘基的結(jié)構(gòu)Subtilase超家族蛋白酶對底物的水解過程是酶的S2′、S4-S1底物結(jié)合區(qū)域與底物的P4-P2′(至少6個(gè)氨基酸殘基)相結(jié)合,然后通過催化三聯(lián)體的作用把底物分子切斷.因此,酶的底物結(jié)合區(qū)域?qū)υ撁傅乃馓禺愋院碗逆I選擇性至關(guān)重要.根據(jù)圖4-6,對SP1與蛋白酶K的底物結(jié)合區(qū)域比較分析如下:兩種蛋白酶的S2′主要由207、238和239三個(gè)保守的疏水性氨基酸殘基構(gòu)成.S1是主要由147-150和173-176片段形成的明顯大口袋,底部為184,頂部為239-242片段(催化三聯(lián)體的絲氨酸殘基位于該片段上),邊緣為177.除177位點(diǎn)的殘基以外(該位點(diǎn)在SP1中是帶負(fù)電荷的D,而蛋白酶K是不帶電荷的N),形成S1的主要?dú)埢?個(gè)蛋白酶中均很保守.氨基酸帶電荷性質(zhì)的差異對蛋白酶的水解特性和肽鍵選擇性影響較大,特別是底物結(jié)合區(qū)域的殘基帶負(fù)電荷能顯著增強(qiáng)蛋白酶催化域的柔性;對于D和N而言,這兩個(gè)氨基酸殘基的構(gòu)象相似,帶電荷不同,這可能導(dǎo)致兩種蛋白酶的水解特性具有差異,并且可能增強(qiáng)SP1的S1柔性,提高SP1催化效率.S2位于107和76(該位點(diǎn)是催化三聯(lián)體中的組氨酸殘基)之間,底部是103和44(該位點(diǎn)是催化三聯(lián)體中的天冬氨酸殘基),底部末端是45,邊緣是74.兩個(gè)蛋白酶的S2均小于S1,且氨基酸殘基均保守.對于S3而言,由于與之結(jié)合的底物P3殘基朝向溶劑且遠(yuǎn)離酶;因此,兩個(gè)酶的S3主要是由保守Ser108殘基在酶表面形成一個(gè)凸起,而不是一個(gè)口袋形狀;緊鄰的G107殘基也可能與底物的P3殘基側(cè)鏈具有相互作用,協(xié)助蛋白酶結(jié)合底物.S4具有明顯的口袋形狀,位于107-111和147-151片段之間,可進(jìn)一步分為兩個(gè)小口袋,即S4a和S4b.S4a側(cè)面為L148,邊緣G109,底部為L103和V114(在蛋白酶K中為I).雖然V與I殘基的性質(zhì)和構(gòu)象相似,但是V殘基的側(cè)鏈比I殘基少1個(gè)—CH2基團(tuán);因此,V殘基占據(jù)的空間小些.由于該殘基側(cè)鏈位于S4a底部,因此SP1的S4a可能比蛋白酶K大些,可容納側(cè)鏈相對較大的底物.S4b主要由底部為L156(在蛋白酶K中為V)、邊緣為150和151、側(cè)面為M111(在蛋白酶K中為Y)的殘基構(gòu)成.對于S4而言,在蛋白酶K中的Y殘基像一個(gè)靈活的蓋子;而在SP1中為M殘基,該殘基為非極性且未帶苯環(huán),相對于蛋白酶K而言,M殘基更利于底物P4殘基進(jìn)入SP1的S4,同時(shí)也增強(qiáng)了S4的疏水性.對于L/V殘基而言,這兩個(gè)構(gòu)象和性質(zhì)相似的殘基均分別包埋兩個(gè)蛋白酶的S4b底部,對S4影響較小.2.8蛋白酶k和sp1的鹽鍵計(jì)數(shù)大量廣泛的氫鍵對維持蛋白酶整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用,相對而言鹽鍵有助于蛋白酶局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.蛋白酶K的氫鍵數(shù)為191,而SP1的氫鍵數(shù)少些,為155.以氨基酸殘基間相距0.7nm以內(nèi)且?guī)喾措姾傻?個(gè)殘基形成1個(gè)鹽鍵計(jì),蛋白酶K的鹽鍵數(shù)為21,而SP1的鹽鍵數(shù)為33;其中部分鹽鍵位點(diǎn)氨基酸殘基較保守,如R13:D202鹽鍵能促進(jìn)兩種酶的N端的穩(wěn)定,R57:D/E(1IC6中):R87三個(gè)氨基酸殘基之間的鹽鍵分別對α2與β4、α3與β5之間的空間關(guān)系具有穩(wěn)定作用.由此可見,蛋白酶K和SP1的氫鍵、鹽鍵的數(shù)量及位置具有差異,因此,這可能是這兩種酶的柔性、催化特性和穩(wěn)定性等方面具有差異的原因之一.2.9sp1基氧原子與ca2+蛋白酶與Ca2+結(jié)合能提高酶的熱穩(wěn)定性和抗水解作用.對蛋白酶K而言,該酶能與兩個(gè)Ca2+相結(jié)合.在蛋白酶K中,Ca1位點(diǎn)是D215殘基的側(cè)鏈羰基氧原子,V192和P190兩個(gè)殘基主鏈羰基的氧原子結(jié)合Ca2+,對蛋白酶K的β9-β10和β10-β11