基于在線智能檢測的醋發(fā)酵過程溫度和ph值檢測

鎮(zhèn)江醋歷史悠久。這是固體分層發(fā)酵技術的典型代表之一。這種制備的醋具有“酸、澀、香、甜、濃、鮮、香”的特點，深受國內外消費者的喜愛。它是以優(yōu)質糯米、麩皮等為主要原料,經“固態(tài)分層”發(fā)酵工藝釀造制得,它是典型的多菌種混合發(fā)酵工藝,曾獲“國家非物質文化遺產”稱號。在醋醅發(fā)酵過程中,隨著發(fā)酵時間和環(huán)境條件的變化,在以醋酸菌為主的多種微生物作用下酒精逐漸轉化成醋酸,并伴有各種代謝產物的生成,如有機酸、氨基酸以及多種揮發(fā)性物質等,以至于發(fā)酵醋醅的酒精度、酸度和水分等在各階段均發(fā)生不同程度的變化。另外,不同的發(fā)酵階段的操作工藝也有很大的差別。將發(fā)酵過程分為不同階段,有利于進一步探究固態(tài)發(fā)酵過程,優(yōu)化發(fā)酵條件,提高發(fā)酵效率。近年來,國內外對于食醋釀造行業(yè)的研究主要集中在:1)依據醋醅中微生物生物量研究醋醅發(fā)酵過程,如許偉等人;2)醋酸菌分離,以及固態(tài)發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的研究,如包啟安等人詳細闡明了鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵工藝中不同微生物的作用等;3)食醋中氧化性成分研究,新品醋(保健醋等)的研制開發(fā)等,然而他們對醋醅固態(tài)發(fā)酵過程中溫度、pH值的變化缺乏較深入的研究,尤其針對不同發(fā)酵階段的分析幾乎沒有。本文對鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵溫度進行全過程跟蹤,通過溫度、pH值等重要理化指標和近紅外光譜表征醋醅發(fā)酵過程的各個階段,為進一步監(jiān)控醋醅發(fā)酵過程提供一定的基礎。依據檢測結果將固態(tài)發(fā)酵過程分為不同階段,為優(yōu)化發(fā)酵條件,合理改善操作工序,以期提高醋醅的發(fā)酵效率和質量。1材料和方法1.1發(fā)酵醋光譜的測定試驗地點:鎮(zhèn)江恒順香醋廠。以醋醅為試驗樣品,檢測規(guī)格相同且同時接種的發(fā)酵缸A和B。首先,對發(fā)酵溫度進行24h實時跟蹤檢測,然后,每天在翻醅前采樣。取樣時,選擇3個深度的點,并保證兩組發(fā)酵池以同樣的方式取樣,即自上而下(30,50,70cm處)取樣。迅速將其混合均勻,裝入取樣袋,立即取回,作為測試理化指標和近紅外光譜的樣品。整個試驗實時跟蹤檢測了發(fā)酵過程中溫度、pH值變化,使用近紅外光譜技術采集發(fā)酵醋醅的光譜,利用主成分分析法(PCA)和K-最鄰近法(K-nearestneighbors,KNN)模型對不同發(fā)酵時間的醋醅樣品光譜進行分析。依據結果,將固態(tài)發(fā)酵過程分為不同階段。1.2儀器和方法1.2.1溫度傳感器工作原理采用自行研制的溫度智能采集模塊,通過采集軟件用電腦(HPcompaqdx2310MT,上?；萜沼邢薰?和熱電阻溫度傳感器(PT100,測量范圍-200~850℃,分辨率0.1℃,精度±0.3℃)24h實時監(jiān)控醋醅發(fā)酵過程中溫度的變化。每個溫度傳感器表面進行抗酸化處理,使其可持續(xù)在高酸度環(huán)境下工作,而不失去靈敏度。采集到的溫度數(shù)據經RS-232總線傳送到主機,實時記錄并存儲溫度信息,存儲速率1min/次。該模塊的分辨率是0.1℃/0.1Ω,在-20~85℃,濕度<95%的條件下正常運行。1.2.2ph值的檢測稱取10g醋醅樣品,加入50mL蒸餾水浸泡30min,攪拌器攪拌5min,然后用3層紗布過濾,取濾液。用酸度計(型號pHs-3B,上海機密科學儀器有限公司)直接插入濾液中檢測pH值。每個樣品做3次平行試驗,取其平均值,作為該樣品的pH值。1.2.3近紅外光譜數(shù)據的獲取用AntarisⅡ型傅里葉變換近紅外光譜儀(ThermoFisherScientific,美國)采集醋醅樣品的近紅外光譜數(shù)據,通過Y型光纖和光箱進行連接,采集到的光譜信息數(shù)據通過USB接口傳輸?shù)接嬎銠C。本試驗選擇在10000~4000cm-1的波數(shù)范圍進行光譜掃描,以盡量全面地獲取樣品在近紅外區(qū)域的光譜信息。試驗過程中,室內溫度25℃,分辨率為8cm-1,掃描次數(shù)16次,每條光譜得到1557個變量。每個樣品采集3次,取其平均值作為該樣本的原始光譜。2結果與分析2.1不同發(fā)酵層溫度的變化在固態(tài)發(fā)酵過程中,溫度是衡量醋醅發(fā)酵質量的綜合指標之一。它的變化決定醋醅的發(fā)酵效率和質量。這是因為在發(fā)酵過程中溫度影響微生物的代謝活性以及酒精和水分的變化。在適宜的溫度下,微生物快速繁殖代謝,不僅將醋醅中的酒精迅速轉化成醋酸,而且可代謝產生大量的有機酸、氨基酸、酯類等物質。圖3顯示用溫度傳感器檢測的不同發(fā)酵層溫度的變化曲線。根據溫度變化趨勢將發(fā)酵過程分成4個階段,即提熱期、調整期、穩(wěn)定期和衰減期。1)提熱期,是將代謝最為旺盛的醋酸菌(10~11d的醋醅)等微生物套醪接種到新鮮醋醅中,其溫度在15~18h達到最高,這一過程能有效的消滅或抑制新接種缸中的雜菌;2)調整期,其溫度在38~43℃之間,利于醋酸菌等微生物迅速地生長繁殖;3)穩(wěn)定期,其溫度在38~46℃之間,是醋酸菌等微生物代謝最旺盛的階段,產物大量積累,香醋主要風味骨架物質生成,并產生大量的熱;4)衰減期,即發(fā)酵后期,由于養(yǎng)分的消耗以及代謝產物的大量積累,抑制醋酸菌等微生物代謝,溫度隨之降低,維持在35~42℃。2.2ph值對醋酸發(fā)酵的影響pH值在發(fā)酵過程中不斷發(fā)生變化,這是因為細胞或基質消耗會產酸,它對細胞生長及產物的形成產生重要的影響,因此pH值是發(fā)酵過程中微生物在一定環(huán)境下代謝活動的綜合指標。在整個發(fā)酵過程中,pH值變化幅度基本保持在3.65~3.99范圍。相關文獻表明,pH值對醋酸菌的生長和代謝有很大的影響,當pH低于3.4時,醋酸菌等微生物對氧氣的供給要求很嚴格,低濃度的氧氣造成細菌數(shù)量急劇下降。pH值在3.65~3.99時利于醋酸菌的生長和產酸,也可有效抑制其他雜菌的生長代謝。在圖4中,從pH值變化的趨勢可將發(fā)酵過程分成3個階段,即速升期、下降期和平穩(wěn)期。速升期,醋酸菌等微生物快速生長繁殖,消耗醋醅中原有的營養(yǎng)物質,且代謝產物積累較少,游離H+少,使得pH值迅速升高;下降期,微生物代謝加速,經翻醅增加養(yǎng)料和氧氣,使得微生物代謝旺盛,不斷將酒精轉成醋酸和其他有機酸等產物,pH值逐漸降低;平穩(wěn)期,即隨著養(yǎng)料逐漸被消耗及代謝產物的大量積累,微生物代謝不斷減慢,使得pH值變化幅度很小,維持在3.65~3.99之間。2.3醋：現(xiàn)代紅外光譜分析2.3.1pca和k-最鄰近法,k-nv的預處理采集到的醋醅光譜,由于儀器、樣本背景及其他因素的影響,所以常出現(xiàn)噪聲、譜圖基線漂移等現(xiàn)象,這是因為醋醅是由糠和麩皮等組成的,其均勻度不能保證完全一致,影響光在樣本中的傳播。為了消除這些不利因素對建模的影響,經多次嘗試,采用標準正態(tài)變量變換(SNV)對原始光譜進行預處理,來消除固體顆粒的大小以及光程變化對NIR漫反射光譜的影響。經SNV處理后的效果如圖5所示(a處理前,b處理后)。利用主成分分析(PCA)和K-最鄰近法(K-nearestneighbors,KNN)對預處理后的光譜數(shù)據建立模型,區(qū)分發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的醋醅。數(shù)據處理采用Matlab7.4軟件。2.3.2出峰位置及分布醋醅中含有大量與醋醅發(fā)酵品質相關的有效成分(如乙醇、有機酸、氨基酸、水分等),這些成分大多存在含氫基團(C-H、O-H、和N-H等),不同基團在近紅外區(qū)域的吸收強度和吸收位置均有所不同。同時,氫鍵的存在、基團的數(shù)量等也影響峰強度和位置。根據朗伯-比爾定律和近紅外譜圖,可以確定與化學結構相關的一些性質。不同發(fā)酵階段的醋醅,其物質種類和含量均有差異,這些差異在特定波長下表現(xiàn)為光的吸收強度和出峰位置。各波段對應的峰以及強度能反映不同的基團物質種類和含量。由圖6可知,將發(fā)酵過程分成4個階段,不同階段的同一種物質的峰高是有差別的。其中,1號峰在4500~4750cm-1之間,一般以氨基類為主。發(fā)酵前期,微生物繁殖迅速,R-NH2類等代謝產物積累較少;發(fā)酵中期,由于代謝活躍,多種代謝產物逐漸積累,與發(fā)酵后期相比,中期該現(xiàn)象明顯。2號峰在5000~5280cm-1之間,一般以RCOR為主,因醋醅是以糠、麩皮和酒醪為主要原料發(fā)酵的,故在第1階段酒精含量很高,隨著發(fā)酵時間的延長,微生物迅速將酒精轉化成醛類等中間物質,進而被氧化成醋酸,使發(fā)酵后期酒精含量很低。3號峰在5800~6000cm-1之間,一般以R-COOH物質為主,在醋酸固態(tài)發(fā)酵過程中存在眾多的醋酸菌、乳酸菌等微生物,隨著發(fā)酵的進行,它們生成大量的有機酸,至發(fā)酵后期,醋醅中的酸類以乳酸和醋酸為主,占總有機酸70%以上。4號峰在6700~7100cm-1之間,主要以H2O為主,在第1階段水分含量相對較多,中間階段由于微生物代謝,所以水分減少。5號峰是在8500~8800cm-1之間,一般為代謝中間物質,以-CH等為主。第1階段,微生物處于調整期,代謝中間產物積累較少,其他3個階段中間產物的積累量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸減少。2.3.3醋主成分分析由于醋醅中含有大量的有機酸、氨基酸、酯類、酒精等物質,這些成分的含氫基團均在近紅外區(qū)域產生倍頻和合頻吸收,導致醋醅樣品的近紅外數(shù)據之間存在相關性,大量的信息冗余。在建模時,模型的預測性會因這些冗余信息的介入而大大降低。主成分分析(PCA)是把多個指標化為幾個綜合指標的1種統(tǒng)計方法。對這些特征變量進行主成分分析十分必要。經分析,取前3個主成分因子得分向量作圖。圖7為醋醅樣品通過PCA分析處理后所獲取的前3個主成分得分圖,它表現(xiàn)為樣本點在三維平面上的投影,其中前兩個主成分的貢獻率分別為98.69%和1.0016%,累計貢獻率達到99.92%。這表明當發(fā)酵過程分成3個階段時,采用PCA可將不同階段區(qū)分開來。發(fā)酵中期和后期,醋醅發(fā)酵過程是1個連續(xù)動態(tài)的過程,由圖7可以看出,過杓和露底階段有一定的重疊,不能被完全分開。2.3.4主成分數(shù)對k值及主集分析的影響在主成分分析的基礎上,利用KNN對該結果進行分析。KNN模型的輸入量為醋醅近紅外光譜的主成分得分,輸出量為不同發(fā)酵階段的醋醅所對應的類別,做數(shù)據處理。在KNN模型識別的過程中,輸入的主成分數(shù)對模型的識別結果有較大的影響,經反復優(yōu)化,選取前10個主成分數(shù)和10個K值。同步對KNN模型進行優(yōu)化分析。依據pH值的分析結果,以訓練集中醋醅分3個階段的識別率作為優(yōu)化結果的評判依據。圖8a顯示采用不同K值和主成分數(shù)時,KNN模型對訓練集中醋醅發(fā)酵階段區(qū)分的識別率。當K=1,主成分數(shù)為10時,用最優(yōu)KNN模型對發(fā)酵階段的獨立醋醅樣本進行預測,識別率是78.55%。依據溫度分析結果,以訓練集中醋醅分4個階段的識別率作為優(yōu)化結果的評判依據,進行醋醅發(fā)酵階段的識別分析。當K=3,主成分數(shù)為10時,識別率最高為90.04%,明顯比分3個階段時高很多。3固體發(fā)酵過程各階段的模型建立對鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵進行全過程跟蹤,得出以下結論:1)依據溫度的變化情況可將醋醅固態(tài)發(fā)酵過程分成提熱、調整、穩(wěn)定和衰減期4個階段;2)依據pH值的變化,可將固態(tài)發(fā)酵過程分