膠原-殼聚糖膠原-納米羥基磷灰石仿生支架材料的制備及生物相容性研究

因此，組織工程將骨軟骨膜修復軟骨缺損作為新趨勢。隨著材料科學和生物力學的發(fā)展,采用組織工程方法構建形態(tài)、內部結構及生物力學性能均合適的組織工程骨軟骨雙相支架材料,有望解決這一難題。本研究依據(jù)仿生原理采用膠原-納米羥基磷灰石聚乳酸(nano-hydroxyapatite-collagen-polylacticacid,nHAC-PLA)作為軟骨下骨層,在其上方合成膠原-殼聚糖(collagen-chitosan,Col-CS)作為軟骨層,制備組織工程骨軟骨支架——Col-CS/nHAC-PLA仿生支架,并參考《醫(yī)療器械生物學評價》及ISO10993系列標準檢測生物相容性,為其在骨軟骨缺損修復領域中的應用提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗試劑與儀器普通級4周齡昆明小鼠20只,雌雄不限,體重(20±3)g;成年新西蘭大白兔28只,雌雄不限,體重(2.2±0.3)kg;均由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。Ⅰ型膠原蛋白(從鼠尾腱中提取)、1,4二氧六環(huán)(分析純)、PLA(相對分子質量250×103)、骨粉(nHAC,即吸附有nHA的膠原纖維),均由清華大學材料科學與工程系制備;CS(分析純,北京化學試劑有限公司);L-DMEM(GIBCO公司,美國);MTT試劑盒(Sigma公司,美國)。FD-4冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);353型自動酶標儀(LabsystemsDragon公司,芬蘭);722G可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);ThermoFormaCO2孵育箱(Thermo公司,美國);IX70倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本);LDZ5-2型自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。1.2仿生支架的制備由清華大學材料科學與工程系參照文獻方法制備Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。(1)制備nHAC-PLA溶液:以1,4二氧六環(huán)為溶劑,按8%質量濃度加入PLA,攪拌溶解2d,靜置1h去除氣泡。取與PLA固體量相同的nHAC加入PLA溶液中,再次攪拌溶解2d,靜置1h去除氣泡,備用。(2)制備Col-CS溶液:以2%醋酸溶液為溶劑,配制濃度為2%的CS純溶液及1%的Col純溶液,將兩種溶液按質量比(M/M)20∶1混合,磁力攪拌使其充分反應,備用。(3)取干燥通孔聚四氟乙烯模具,用透明醫(yī)用膠布封閉模具一端孔洞,向模具中倒入制備的nHAC-PLA溶液至模具80%位置,震動模具,排出溶液中氣泡,置于—20℃冰箱中預凍1h。取出模具加入Col-CS溶液,高出nHAC-PLA材料約2mm,放入—20℃冰箱中預凍4h,—50℃、10Pa條件下冷凍干燥72h成形,即為Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。取出支架放入大燒杯中,在—50℃、10Pa條件下于冷凍干燥機中放置10d,使殘留1,4二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。1.3實驗用浸提介質細胞毒性實驗所用浸提介質為L-DMEM,急性全身毒性實驗、皮內刺激實驗、熱原實驗及溶血實驗所用浸提介質為生理鹽水。支架材料與浸提介質按0.2g材料∶1mL介質比例配比,浸提條件為37℃、(72±2)h,將浸提液過濾除菌,4℃冰箱保存、備用。1.4觀測指標1.4.1分組和注射鹽水參照文獻方法進行實驗。取20只小鼠隨機分成兩組,每組10只。實驗組按照50mL/kg劑量腹腔注射浸提液,對照組注入等量生理鹽水。于注射后24、48、72h觀察動物存活情況、一般情況以及毒性反應。1.4.2皮膚長期刺激試驗參照文獻方法進行實驗。取3只新西蘭大白兔,于每只動物脊柱兩側各取10個點(共60點),隨機分為3組,每組20個點。分別于各點皮內注射0.2mL浸提液(實驗組)、0.2mL生理鹽水(陰性對照組)及0.2mL20%乙醇(陽性對照組)。于注射后15min及24、48、72h觀察注射局部皮膚及周圍組織的紅斑及水腫狀況,參照皮膚反應記分系統(tǒng)評定原發(fā)刺激指數(shù)(primaryirritationindex,PII),并進行分級:極輕微刺激為0~0.5分;輕度刺激為0.5~2.0分;中度刺激為2.0~5.0分;強度刺激為5.0~8.0分。1.4.3不同劑量耳緣進行注射參照文獻方法進行實驗。取3只新西蘭大白兔,于實驗前30min測量體溫3次,取平均值作為正常體溫(T0)。按照10mL/kg劑量耳緣靜脈注射浸提液,注射后每隔1h測體溫1次,共3次,記為T1、T2、T3,其中最高1次體溫與T0之差,為體溫升高度數(shù)。以每只兔體溫升高數(shù)均<0.6℃或3只兔體溫升高總和<1.3℃判定為合格。1.4.4測定兔耳緣磷酸鈉溶血率a參照文獻[14-15]方法進行實驗。取1只新西蘭大白兔,耳緣靜脈抽血8mL,用1mL2.5%枸櫞酸鈉抗凝后,加入生理鹽水10mL稀釋,備用。取浸提液(實驗組)、蒸餾水(陽性對照組)、生理鹽水(陰性對照組)各10mL置于3個離心管中,于37℃水浴預溫30min,然后各管分別加入兔耳緣靜脈血0.2mL,混勻,37℃水浴保溫60min。觀察有無溶血后,以離心半徑15cm、2000r/min離心5min,吸取上清液,用722G可見分光光度計在545nm波長處測量各管吸光度(A)值,每組設6個平行樣品,計算溶血率:溶血率(%)=(實驗組A值-陰性對照組A值)/(陽性對照組A值-陰性對照組A值)×100%。判斷標準:溶血率≤5%,表明材料符合生物材料和醫(yī)療器械溶血要求;溶血率>5%,表明材料有溶血作用。1.4.5細胞毒性檢測參照文獻方法進行實驗。取3只新西蘭大白兔髂骨骨髓,采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs及傳代,取第2代細胞懸液,調整細胞密度為1×104個/mL,接種至96孔板(100μL/孔)。培養(yǎng)24h后更換為浸提液培養(yǎng)(實驗組),分別以10%FBS培養(yǎng)液及含0.64%苯酚的培養(yǎng)液作為陰性對照組及陽性對照組,每組設30孔。培養(yǎng)24、48、72h后倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài),隨后每組各取10孔,每孔加入1mg/mL的MTT50μL,繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)液,加入DMSO150μL,振蕩10min,在酶標儀上于490nm波長處測定A值,計算細胞相對增殖率(relativegrowthrate,RGR)。RGR(%)=(實驗組A值-空白A值)/(陰性對照組A值-空白A值)×100%,根據(jù)RGR值評定材料的毒性分級。評定標準:≥100%為0級,75%~100%為Ⅰ級,50%~75%為Ⅱ級,25%~50%為Ⅲ級,1%~25%為Ⅳ級,<1%為Ⅴ級。細胞毒性0~Ⅰ級為合格;Ⅱ級應結合細胞形態(tài)綜合評價;Ⅲ~Ⅴ級為不確定。1.4.6術后處理及并發(fā)癥參照文獻方法進行實驗。將Col-CS/nHAC-PLA仿生支架材料制成直徑4mm、厚5mm(軟骨層2mm、軟骨下骨層3mm)的圓柱形,以60Co照射消毒后,備用。取18只新西蘭大白兔,肌肉注射氯胺酮(50mg/kg)及異丙嗪(5mg/kg)麻醉后,暴露雙側髕股關節(jié),于其中一側股骨關節(jié)面上制備1個直徑4mm、深5mm的孔,包括關節(jié)面軟骨及軟骨下骨,制備關節(jié)軟骨缺損模型。植入制備的支架材料,輕輕打壓,以維持植入物穩(wěn)定性,并以髕骨覆蓋,逐層縫合,作為實驗組。對側肢體僅制備相同規(guī)格孔,未作任何處理,作為對照組。術后不予固定,自由活動,連續(xù)3d肌肉注射慶大霉素預防感染。術后觀察動物飲食、活動、精神狀態(tài)、切口愈合情況、關節(jié)活動度及死亡情況等。于術后4、8、12周分別處死6只動物,暴露雙側關節(jié)腔,大體觀察實驗組材料有無下陷及脫出,兩組缺損修復情況、材料周邊軟骨及髕骨關節(jié)面退變情況及滑膜增生程度等;取兩組標本制備切片行HE染色,觀察材料周邊組織反應及材料降解情況。1.5統(tǒng)計方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗;檢驗水準α=0.05。2結果2.1兩組患者急性毒性反應比較實驗組小鼠一般情況良好,活動、進食均正常,呼吸平穩(wěn),無腹部刺激癥、腹瀉、運動減少、驚厥、癱瘓等毒性反應及死亡,與對照組相比無明顯差異。2.2pii的測定實驗組與陰性對照組各點皮膚及周圍組織未見充血、水腫、壞死等反應,PII均為0分,為極輕微刺激;陽性對照組各點皮膚出現(xiàn)不同程度紅斑、水腫,PII平均6.3分,為強度刺激。2.3大白兔體溫測定新西蘭大白兔體溫升高為0.1~0.2℃,均小于0.6℃,3只大白兔體溫升高總和為0.4℃,小于1.3℃,符合規(guī)定標準,表明無熱原反應存在。2.4對照組及溶血率實驗組和陰性對照組均無明顯溶血現(xiàn)象,陽性對照組出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。實驗組、陰性對照組及陽性對照組A值分別為0.027±0.003、0.016±0.003及0.813±0.031,實驗組溶血率平均為1.38%,符合溶血率≤5%標準,表明支架材料符合生物材料和醫(yī)療器械溶血要求。2.5小鼠骨髓細胞體增殖情況培養(yǎng)24h,陽性對照組見部分細胞未貼壁,呈懸浮死細胞,已貼壁細胞形態(tài)正常,呈梭形和多角形;實驗組和陰性對照組細胞幾乎全部貼壁,細胞形態(tài)正常。48h,陽性對照組見部分貼壁細胞胞體變小、變圓,數(shù)量較前無明顯增多;實驗組和陰性對照組細胞形態(tài)正常,數(shù)量增多。72h時,陽性對照組見大部分貼壁細胞胞體變小、變圓,核固縮,呈中毒狀態(tài),死細胞數(shù)增多;實驗組和陰性對照組細胞形態(tài)正常,數(shù)量明顯增多,有細胞集落形成。見圖1。各時間點陽性對照組A值均顯著低于實驗組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陰性對照組A值與實驗組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。各時間點實驗組毒性分級均為Ⅰ級,陰性對照組為0級,陽性對照組為Ⅳ級。表明支架材料符合體外細胞毒性實驗要求,合格。2.6骨移植實驗2.6.1飼養(yǎng)情況的動物實驗動物均存活至實驗完成。術后1~2d動物精神狀態(tài)較差,進食減少,術肢活動較少,局部有輕度紅腫。2d后進食增加,精神狀態(tài)好轉,術肢活動逐漸恢復正常,切口愈合良好。2.6.2材料周邊軟骨組織的填充面及周邊間隙由大量纖維肉芽組織填充,周邊軟骨無明顯退變,髕股關節(jié)面光滑,無磨損;8周時材料表面及周邊間隙由白色纖維組織填充,與周邊關節(jié)面齊平;12周時材料周邊由部分軟骨組織替代,填充材料與軟骨的間隙。對照組:4周時部分纖維肉芽組織填充空洞,逐漸接近關節(jié)表面;8周時纖維肉芽組織仍未能完全填充空洞,周邊軟骨及髕股關節(jié)面出現(xiàn)退變;12周時空洞由部分纖維組織填充,表面不平整,周邊軟骨及髕股關節(jié)面出現(xiàn)不同程度退變。見圖2。2.6.3評分網(wǎng)孔材料表面可調式因子實驗組:4周時材料表面及周邊間隙由纖維肉芽組織充填,大量炎性細胞浸潤,材料與周邊組織邊界清楚,嵌合牢固,部分纖維組織長入支架材料網(wǎng)孔中。8周時材料周邊炎性反應緩解,網(wǎng)孔中有大量纖維組織長入,并出現(xiàn)部分膠原成分及鈣化,表層部分關節(jié)軟骨向材料表面爬行生長,下層材料與軟骨下骨嵌合牢固并部分降解。12周時下層網(wǎng)孔材料中有大量組織填充,新生骨逐漸礦化,與周邊軟骨下骨融為一體,上層材料與周邊軟骨間隙消失,關節(jié)軟骨朝向材料表面繼續(xù)爬行生長,周邊軟骨無退變。見圖3。對照組:4周時缺損處由纖維肉芽組織從基底部向上填充,大量炎性細胞浸潤,關節(jié)軟骨邊緣變鈍,厚度減小。8周時缺損處纖維肉芽組織發(fā)生部分鈣化,未能填平關節(jié)面,表面不平整。12周時缺陷處表面凹凸不平,上層主要為纖維,且纖維組織排列紊亂,未形成透明軟骨,周邊軟骨變薄,出現(xiàn)不同程度的剝脫、分離和退變。見圖4。3col-cs/nhac-pla一體化復合材料的生物生物兼容性評價臨床上許多與軟骨相關的損傷常涉及軟骨下骨,軟骨下骨正常結構破壞會導致其力學性能改變,修復組織早期愈合率低,最終造成新生組織軟化退變。研究表明,修復軟骨的同時修復軟骨下骨,可以較好模擬軟骨修復微環(huán)境,從而獲得相對理想修復效果。因此,構建能同時修復關節(jié)軟骨和軟骨下骨的一體化組織工程骨軟骨,成為了目前研究熱點。研究表明,組織工程骨軟骨復合組織塊修復軟骨缺損的效果明顯優(yōu)于組織工程軟骨。本實驗以nHAC-PLA作為軟骨下骨層,采用“鑲嵌”方式在其上方合成Col-CS作為軟骨層,構建軟骨下骨層與軟骨層緊密連接的一體化骨軟骨雙相支架材料。該材料根據(jù)軟骨與骨基質結構不同分層構建,表層類似軟骨基質結構,由成型性好的CS與細胞親和性好的Ⅰ型膠原復合而成,制備出成分和結構上仿天然軟骨層的多孔支架——Col-CS,其底層為垂直孔結構,中層為圓形孔結構,頂層為致密孔結構,各層間無明顯分界,連通性好,與天然軟骨結構相似,且在濕潤狀態(tài)下各層力學性能有差異,有望更好的維持軟骨細胞表型和提高軟骨損傷修復效果。軟骨下骨層是基于仿生理念制備的礦化膠原基骨修復材料——nHAC-PLA,其孔徑為100~300μm,孔壁厚為15~30μm,孔隙率約90%,且各孔相互連通,在成分和結構上與天然骨基質相似。本實驗通過冷凍干燥法及溶液互溶法,使軟骨下骨層與軟骨層成為完整一體,避免出現(xiàn)分層現(xiàn)象。此外,軟骨下骨層支架材料具有較大硬度,有利于支架材料早期固定,從而解決組織工程骨軟骨早期固定問題。支架材料植入體內后骨層可與軟骨下骨組織快速整合,從而達到移植物固定的目的,提供軟骨再生所需要的生理及力學環(huán)境,有利于獲得更好的交界區(qū)整合,防止遠期退變。任何一種生物材料應用于臨床,不僅需要具備與機體組織相匹配的理化特性和生物力學性能,還應具備良好的生物相容性。本實驗主要參照GB/T16886和ISO10993系列標準選擇以上6項實驗來評價Col-CS/nHAC-PLA一體化復合材料的生物相容性。驗組組織學觀察(HE×200)a4周,黑色箭頭示肉芽組織及炎性細胞,黃色箭頭示纖維組織長入支架網(wǎng)孔中b8周,黑色箭頭示炎性反應較前緩解,黃色箭頭示膠原形成c12周,黑色箭頭示新生軟骨組織向材料表面爬行生長,黃色箭頭示新生骨小梁圖4術后各時間點對照組組織學觀察(HE×200)a4周,箭頭示纖維肉芽組織增生b8周,箭頭示纖維肉芽組織未能填平關節(jié)面,表面不平整c12周,黑色箭頭示周邊軟骨變薄并剝脫,黃色箭頭示缺損區(qū)表面纖維組織排列紊亂急性全身毒性實驗是一種非特異性急性毒性實驗,將材料浸提液通過靜脈或者腹腔注射于動物體內,觀察其生物學反應,以判斷材料的急性毒性。本實驗中,動物腹腔注射支架材料浸提液后,未見明顯全身急性毒性反應,表明支架材料未對動物機體